SARI抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及肺腺癌轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目前肺癌已成為癌癥死亡的主要原因，在許多地區(qū)其發(fā)病率、死亡率都上升為惡性腫瘤的首位。其原因除了肺癌的生物學(xué)特性十分復(fù)雜，惡性程度較高外，更重要的是肺癌患者在臨床診斷時(shí)已發(fā)生了局部或廣泛的轉(zhuǎn)移，肺癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移機(jī)制及相應(yīng)的治療研究是現(xiàn)代腫瘤研究的一個(gè)重要方向。近年來肺腺癌在肺癌中所占比例明顯增加，成為最常見的組織學(xué)類型之一，且肺腺癌容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。
　　上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchyma transition，

2、EMT)是以上皮細(xì)胞極性喪失及間質(zhì)細(xì)胞特性獲得為主要特征，存在于人體多個(gè)的生理病理過程中。EMT是上皮細(xì)胞來源腫瘤局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要途徑，并且在其間扮演重要角色。目前，EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用成為研究熱點(diǎn)，其發(fā)生及調(diào)控機(jī)制對于尋找惡性腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)，進(jìn)行臨床干預(yù)有重要意義。
　　激活蛋白-1抑制因子(SARI，受干擾素調(diào)節(jié))，是一種以亮氨酸拉鏈為基本結(jié)構(gòu)，且含有I型干擾素誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)的早期反應(yīng)基因，可以發(fā)揮選擇性癌細(xì)胞生

3、長抑制作用，?？稍谔囟ǖ恼＜?xì)胞檢測出表達(dá)，包括黑色素細(xì)胞，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，胰腺間質(zhì)細(xì)胞，乳腺及前列腺上皮細(xì)胞，但在其對應(yīng)的上皮惡性腫瘤中而未見表達(dá)，所以通常認(rèn)為SARI可作為一種腫瘤抑制基因。
　　SARI在肺腺癌中的表達(dá)情況尚未見報(bào)道，本論文將通過3部分對SARI介導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞EMT現(xiàn)象及在肺腺癌進(jìn)展轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮的作用及機(jī)制加以闡述：
　　第一部分探究了肺腺癌患者中SARI表達(dá)與EMT標(biāo)志物的關(guān)系，我們按照術(shù)前PET-C

4、T結(jié)果，將有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者分別入組。根據(jù)術(shù)后肺癌TNM分期系統(tǒng)，共篩選了6例Ⅰ期腺癌患者，及7例Ⅲ期患者，采用常規(guī)H&E染色對有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的肺腺癌標(biāo)本及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)病灶進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)原發(fā)病灶與轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞類型一致。與非轉(zhuǎn)移組比較，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌患者中，可見SARI高表達(dá)及E-cadherin的缺失，卻見vimentin、p-GSK-3β及β-catenin表達(dá)增強(qiáng)。在所有被檢驗(yàn)標(biāo)本中，SARI和E

5、-cadherin之間有顯著的相關(guān)性(r=0.8390)，而SARI和vimentin之間卻是具有明顯負(fù)相關(guān)(r=0.7255)。
　　第二部分進(jìn)一步探討了SARI體外調(diào)節(jié)EMT的效應(yīng)及其機(jī)制，我們在一系列肺腺癌細(xì)胞系檢測了SARI的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在NCI-1650、NCI-H1299及CRL5908中SARI是高表達(dá)的；在NCI-H1975、Calu-3及A549中相對較低表達(dá)；而在GLC-82、PG49及HTB-55中幾乎不表達(dá)，

6、當(dāng)轉(zhuǎn)染SARI至GLC-82及PG49細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，由長錘形的纖維細(xì)胞樣的間質(zhì)型(控制組)轉(zhuǎn)化成卵石狀上皮表型(實(shí)驗(yàn)組)，相鄰細(xì)胞間連接變得緊密，細(xì)胞極性也增強(qiáng)。在GLC-82及PG49細(xì)胞，SARI表達(dá)的效應(yīng)是增強(qiáng)E-cadherin及降低vimentin的表達(dá)。相反，當(dāng)內(nèi)源性的SARI基因被敲除后，以肺腺癌NCI-H1650和NCI-H1299為例，二者可被檢測到EMT的過程，細(xì)胞形態(tài)和生物標(biāo)記物發(fā)生改變。
　　為

7、理解SARI調(diào)節(jié)EMT的可能機(jī)制，我們檢測了SARI在GSK-3β-β-catenin信號通路中的效應(yīng)。通過siRNA，使SARI基因表達(dá)下調(diào)，我們觀察到胞漿內(nèi)β-catenin的積聚及向胞核內(nèi)的易位，同時(shí)連于胞膜的β-catenin表達(dá)也下降，此外，當(dāng)轉(zhuǎn)染SARI至GLC-82時(shí)，基于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，GSK-3β與SARI密切聯(lián)系。由于SARI不是磷酸化酶，SARI激活CSK-3β的機(jī)制可能是由一個(gè)獨(dú)立的磷酸化酶介導(dǎo)并與該復(fù)合物密切聯(lián)系

8、。而且基于Ser9(S9，負(fù)性調(diào)節(jié)部位)的磷酸化作用，GSK-3β水平顯著升高及β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄活性(TOP/FOP)下降，同樣的，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SARI-siRNA至NCI-H1650細(xì)胞下調(diào)SARI的表達(dá)可以提高CSK-3β磷酸化作用(S9)及β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄活性，經(jīng)Wnt培養(yǎng)液處理后，效果更加明顯。因此，SARI通過減少S9的磷酸化作用來激活GSK-3β，從而調(diào)節(jié)GSK-3β-β-catenin信號。雖然

9、Wnt僅輕微引發(fā)NCI-H1650細(xì)胞的EMT，但是當(dāng)采用SARI-siRNA對細(xì)胞內(nèi)SARI基因進(jìn)行敲除后，EMT標(biāo)記物顯著增加。反之，恢復(fù)SARI在GLC-82細(xì)胞(不表達(dá)SARI)中的表達(dá)，可防止Wnt誘導(dǎo)的EMT。這表明SARI是Wnt介導(dǎo)的EMT的拮抗劑。由于SARI能激活GSK-3β活性，從而降解胞漿β-catenin及降低胞核β-catenin轉(zhuǎn)錄活性，但是對于過表達(dá)的β-catenin是否能逆轉(zhuǎn)SARI的抑制作用卻是未知

10、的，我們在這方面做了檢測。在轉(zhuǎn)染SARI的細(xì)胞里，逐漸提高β-catenin cDNA劑量可提高β-catenin轉(zhuǎn)錄活性，恢復(fù)EMT的標(biāo)記物，及改變細(xì)胞形態(tài)。相似的，在敲除SARI的NCI-H1650細(xì)胞里，過表達(dá)的β-catenin及過活躍的β-catenin轉(zhuǎn)錄可誘發(fā)EMT，呈現(xiàn)出劑量依賴性，細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生了改變。
　　第三部分通過原位動(dòng)物模型，我們比較了敲除SARI基因的NCI-H1650及對照組細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛質(zhì)。在接種細(xì)胞

11、前，測量并保證每個(gè)亞組里的螢光酶活性一致。采用生物發(fā)光成像技術(shù)(BLI)監(jiān)測腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移的始動(dòng)。一周后，BLI檢測到在接種NCI-H1650-KD細(xì)胞的小鼠體內(nèi)不同部位有明顯的腫瘤轉(zhuǎn)移損害，相反，對照組小鼠5周后僅見原發(fā)部位有腫物，并未見轉(zhuǎn)移征象。免疫組織化學(xué)染色顯示大部分的腫瘤細(xì)胞強(qiáng)烈表達(dá)vimentin，但卻弱表達(dá)E-cadherin和細(xì)胞角蛋白。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為SARI體內(nèi)抑制肺腺癌轉(zhuǎn)移提供強(qiáng)有力的證據(jù)。
　　結(jié)論：

12、>　　SARI蛋白的表達(dá)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)肺腺癌標(biāo)本出現(xiàn)表達(dá)差異，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌組織中明顯下調(diào)，卻見vimentin、p-GSK-3β及β-catenin等EMT密切相關(guān)指標(biāo)表達(dá)增強(qiáng)，在肺腺癌進(jìn)展過程中SARI基因介導(dǎo)的EMT發(fā)揮了關(guān)鍵作用。其機(jī)制可能為SARI拮抗Wnt信號通路介導(dǎo)的EMT過程，由于SARI能激活GSK-3β活性，從而降解胞漿β-catenin及降低胞核β-catenin轉(zhuǎn)錄活性，從而發(fā)揮拮抗