粘細(xì)菌外膜蛋白發(fā)育相關(guān)基因的篩選及功能研究.pdf

1、目的：粘細(xì)菌屬于最簡(jiǎn)單的具有多細(xì)胞發(fā)育結(jié)構(gòu)的生物體之一，其發(fā)育過程與真核生物存在相似性。粘細(xì)菌屬原核生物，生活周期具社會(huì)性行為，是研究多細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生機(jī)制的良好模型。作為細(xì)胞與外界環(huán)境問的界面，細(xì)胞膜幾乎與發(fā)育中各種生物活動(dòng)密切相關(guān)，然而迄今為止所克隆的與粘細(xì)菌發(fā)育相關(guān)的膜蛋白基因數(shù)量非常有限，一些重要的應(yīng)定位于細(xì)胞膜的蛋白因子一直未能找到。本論文擬找出在粘細(xì)菌發(fā)育階段表達(dá)量上調(diào)的膜蛋白基因，并對(duì)這些新蛋白因子進(jìn)行基因敲除實(shí)驗(yàn)，以明確

2、其生物學(xué)功能。 方法：本實(shí)驗(yàn)最初使用雙向電泳技術(shù)對(duì)粘細(xì)菌發(fā)育與非發(fā)育階段細(xì)胞膜蛋白的表達(dá)進(jìn)行了研究。隨后利用六種外膜蛋白預(yù)測(cè)軟件對(duì)粘細(xì)菌基因組讀碼框編碼產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，將六種軟件均預(yù)測(cè)為外膜蛋白的基因篩選出來，分別構(gòu)建轉(zhuǎn)錄融合載體，即將其上游的調(diào)控區(qū)域與報(bào)告基因lacZ相連，經(jīng)電穿孔分別導(dǎo)入粘細(xì)菌野生株DK1622，通過測(cè)定重組菌株β-半乳糖苷酶活性尋找出粘細(xì)菌發(fā)育階段表達(dá)的基因。對(duì)篩選到的基因進(jìn)行基因敲除，觀察該敲除菌株的

3、表型變化以初步明確其生物學(xué)功能。 結(jié)果：1.在雙向電泳實(shí)驗(yàn)中，比較幾次實(shí)驗(yàn)所得到粘細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)性生長(zhǎng)和發(fā)育12h的2-D圖譜，發(fā)現(xiàn)每次實(shí)驗(yàn)均存在一些發(fā)育階段蛋白量明顯增加的點(diǎn)，但是不同次實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較差，我們從中挑選了5個(gè)在兩次以上實(shí)驗(yàn)中蛋白量均有明顯增加的斑點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜分析，但質(zhì)譜分析結(jié)果均沒有得到粘細(xì)菌膜蛋白。2.利用生物信息學(xué)軟件分析，在粘細(xì)菌基因組中篩選出了12個(gè)編碼外膜蛋白的基因。報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果提示其中2個(gè)基因(Mx

4、3106，Mx3883)在發(fā)育起始階段表達(dá)量上升，通過氨基酸序列比較，基因Mx3106所編碼的蛋白與粘細(xì)菌中對(duì)IV型菌毛的形成以及S運(yùn)動(dòng)至關(guān)重要的PilQ同源。Mx3883與革蘭氏陰性菌分子伴侶/引領(lǐng)蛋白通路中的引領(lǐng)蛋白同源，其所在操縱子與粘細(xì)菌孢子外殼蛋白的分泌有關(guān)。其余十個(gè)基因均與物質(zhì)跨膜運(yùn)輸有關(guān)，在發(fā)育階段表達(dá)量均下降或未表達(dá)。其中Mx1316，Mx4559，Mx6044，Mx6579，Mx6911為TonB依賴的外膜蛋白受體，主

5、要在大分子跨膜物質(zhì)運(yùn)輸中起重要作用。3.通過同源重組獲得Mx3106和Mx3883基因敲除菌株。這兩種敲除菌株在營(yíng)養(yǎng)豐富的固體平板表面運(yùn)動(dòng)無異常，在饑餓平板能正常聚集發(fā)育為子實(shí)體，在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)孢子的形成也無影響。 結(jié)論：1.利用生物信息軟件分析粘細(xì)菌基因組讀碼框，預(yù)測(cè)出12個(gè)可能編碼外膜蛋白的基因?；騇x3106和Mx3883在發(fā)育時(shí)期表達(dá)上調(diào)，其余10個(gè)基因在發(fā)育時(shí)期幾乎不表達(dá)或表達(dá)下降，這10個(gè)基因均與物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)