布魯氏菌部分外膜蛋白基因的克隆、表達(dá)及免疫原性研究.pdf

1、布魯氏菌是革蘭氏陰性的兼性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，可以引發(fā)世界范圍內(nèi)人和牲畜及野生哺乳動(dòng)物的感染，也是生物武器研究的熱點(diǎn)。布魯氏菌引發(fā)的傳染性疾病和巨大的經(jīng)濟(jì)損失已經(jīng)引起全世界的關(guān)注。 補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，玫瑰花環(huán)實(shí)驗(yàn)，血清凝集實(shí)驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)等經(jīng)典血清學(xué)診斷均依賴布魯氏菌脂多糖作為抗原檢測(cè)相應(yīng)抗體，主要存在以下的缺陷：1、布魯氏菌脂多糖與其他的革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖存在交叉反應(yīng)，在檢測(cè)過(guò)程中可能出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果；2.不能根據(jù)血清學(xué)檢驗(yàn)鑒

2、別天然感染和接種過(guò)疫苗。因此尋找蛋白抗原成為解決布魯氏菌的診斷中存在的這些缺陷的主要方向。 目前減毒活菌疫苗是預(yù)防布魯氏菌的主要手段，但是由于減毒活疫苗可能存在毒力回復(fù)以及隱性感染等危險(xiǎn)，一直未能應(yīng)用于人類的布魯氏菌預(yù)防。而且和其他細(xì)胞內(nèi)寄生細(xì)菌一樣，布魯氏菌的LPS具有較低的免疫原性，不能引發(fā)足夠清除病原的免疫反應(yīng)，是布魯氏菌能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)存活并繁殖的一個(gè)重要原因，因此尋找蛋白性質(zhì)的抗原具有重要的意義。 國(guó)外的研究工

3、作已經(jīng)對(duì)一些布魯氏菌的外膜蛋白進(jìn)行了免疫原性和保護(hù)性的研究，期待能夠應(yīng)用于布魯氏菌診斷和亞單位疫苗的制備。其中OMOP31、OMP10和bp26均為強(qiáng)免疫原性蛋白并具有保守的DNA序列。尤其是bp26在一些疫苗株中的弱化和缺失對(duì)于鑒別天然感染和疫苗接種具有現(xiàn)實(shí)意義。 在此次研究中我們自布魯氏菌基因組中擴(kuò)增獲得OMP31、OMP10和bp26的基因片斷并克隆至原核表達(dá)載體PGEX-4T-1，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)之后成功表達(dá)了上述三種蛋白

4、，分別命名為GST-OMP31,GST-OMP10和GST-bp26。并通過(guò)western-blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其免疫特性，結(jié)果顯示三種蛋白均能夠被布魯氏菌感染兔血清特異性識(shí)別，而載體蛋白與陽(yáng)性血清并不能產(chǎn)生反應(yīng)，證明這三種蛋白具有良好的抗原特異性，可期待應(yīng)用于布魯氏菌的診斷。 根據(jù)這三種蛋白不同的理化特性，我們采用了不同的純化方式進(jìn)行了蛋白的純化，其中GST-OMP31和GST-bp26獲得了良好的純化效果，而OMP10在

5、純化的過(guò)程中未能夠保持穩(wěn)定，發(fā)生了降解。 純化后的GST-OMP31和GST-bp26蛋白分三次，第一次使用完全弗氏佐劑，后兩次采取不完全弗氏佐劑作為佐劑免疫小鼠。兩種蛋白均能誘導(dǎo)高滴度的體液免疫。通過(guò)淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞因子分析和CD4+、CD8+和CD86+淋巴細(xì)胞亞群分析，結(jié)果顯示GST-OMP31免疫小鼠脾細(xì)胞經(jīng)GST-OMP31刺激之后可以產(chǎn)生IFN-γ而不是IL-4，提示GST-OMP31誘導(dǎo)的是Th1型免疫反應(yīng)。

6、并且能夠誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒反應(yīng)，導(dǎo)致提呈抗原的巨噬細(xì)胞的溶解凋亡。此外，小鼠體內(nèi)CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞記數(shù)的減少提示，GST-OMP31免疫誘導(dǎo)小鼠CD4+淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ從而誘導(dǎo)產(chǎn)生CD8+T細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒作用。結(jié)果顯示，OMP31誘導(dǎo)的免疫主要由CD4+淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，而CD8+淋巴細(xì)胞的作用因此而收到了限制。 GST-bp26相對(duì)于GST-OMP31來(lái)說(shuō)不僅能夠誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)，產(chǎn)生干擾素和特異性細(xì)胞毒細(xì)胞，

7、也能夠誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)，產(chǎn)生IL-4和TNF-α。淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和CD4+、CD8+和CD86+淋巴細(xì)胞亞群分析結(jié)果顯示，Th1型和Th2型免疫反應(yīng)的相互拮抗作用使GST-bp26相對(duì)于GST-OMP31來(lái)說(shuō)能夠維持更長(zhǎng)時(shí)期的免疫保護(hù)作用。 和其他細(xì)胞內(nèi)寄生菌一樣，激活的巨噬細(xì)胞對(duì)于宿主清除感染病原來(lái)說(shuō)是非常重要的。TNF-α能夠激活巨噬細(xì)胞和促進(jìn)炎癥反應(yīng)，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定細(xì)胞因子結(jié)果顯示，GST-OMP31誘導(dǎo)TNF-α