不同長(zhǎng)度戊型肝炎病毒ORF2截短蛋白的免疫原性和抗原性研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　一.截短蛋白pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660的原核表達(dá)及其特性分析
　　由于蛋白質(zhì)能否有效表達(dá)很難預(yù)測(cè)，實(shí)驗(yàn)早期以p179為基礎(chǔ)共設(shè)計(jì)了20個(gè)不同長(zhǎng)度的pORF2截短片段進(jìn)行表達(dá)嘗試。利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了含有HEV ORF2的pET28a重組質(zhì)粒，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，其中13個(gè)截短蛋白可以得到高效表達(dá)。
　　在成功表達(dá)的1

2、3種蛋白中，我們選取了片段較長(zhǎng)的3個(gè)重組蛋白pORF2aa439～4660、pORF2aa422～637和pORF2aa430～660進(jìn)行蛋白質(zhì)的可溶性分析，發(fā)現(xiàn)這3種不同長(zhǎng)度的蛋白都可以在細(xì)菌裂解上清中存在，呈可溶性表達(dá)。最后根據(jù)表達(dá)蛋白所攜帶的His標(biāo)簽，利用鎳離子金屬螯合親和層析技術(shù)獲得了純化蛋白。
　　二.截短蛋白pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660與p179、p166免

3、疫原性和抗原性的比較研究
　　為了進(jìn)一步研究3種不同長(zhǎng)度的截短蛋白與p166、p179的免疫原性和抗原性的差異，將純化后的5種HEV重組蛋白以生理鹽水稀釋至100mg/L，然后分別加入等體積鋁佐劑(1g/L)，顛倒混勻30min，即為制備的實(shí)驗(yàn)性戊肝疫苗。用皮內(nèi)注射的方法分別免疫5組小鼠，每組6只，每只200μl（含抗原10μg），并于首次免疫后的第3周，第5周及第33周各進(jìn)行1次加強(qiáng)免疫，免疫劑量和途徑與首次免疫相同。定期采集小

4、鼠血清，分別用p166、p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660作為包被抗原來(lái)檢測(cè)p166、p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660免疫后血清中的抗-HEV IgG抗體，觀察抗體滴度的升高、維持、下降等變化過(guò)程直至首次免疫后第35周，將同組小鼠的每一份血清在同一稀釋度下所測(cè)OD值取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果如下:
　　A.

5、首次免疫后第3周、第5周、第7周、第15周、第31周和第35周，p166免疫小鼠所得血清用p166包被檢測(cè)，抗-HEV IgG抗體滴度分別為1∶1600、1∶6400、1∶51200、1∶25600、1∶3200和1∶51200;用p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660包板檢測(cè)，抗體滴度相同，分別為1∶800、1∶3200、1∶25600、1∶12800、1∶3200、1∶25

6、600;
　　B.首次免疫后第3周、第5周、第7周、第15周、第31周和第35周，p179免疫小鼠所得血清用p166檢測(cè)，抗-HEV IgG抗體滴度分別為1∶3200、1∶12800、1∶51200、1∶25600、1∶6400、1∶51200;用 p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660包板檢測(cè)，所得抗體滴度相同，均分別為1∶1600、1∶12800、1∶51200、1∶

7、12800、1∶6400、1∶51200;
　　C.首次免疫后第3周、第5周、第7周、第15周、第31周和第35周，pORF2aa439～660免疫小鼠所得血清用p166檢測(cè)，抗-HEV IgG抗體滴度分別為1∶12800、1∶409600、1∶1638400、1∶204800、1∶204800、1∶1638400;用p179包被檢測(cè)，抗體滴度分別為1∶3200、1∶102400、1∶819200、1∶102400、1∶20480

8、0、1∶1638400;用pORF2aa439～660檢測(cè)，抗體滴度分別為1∶6400、1∶102400、1∶409600、1∶204800、1∶204800、1∶819200;用pORF2aa422～637檢測(cè)，抗體滴度分別為1∶3200、1∶102400、1∶409600、1∶204800、1∶204800、1∶1638400;用pORF2aa430～660檢測(cè)，抗體滴度分別為1∶3200、1∶102400、1∶409600、1∶2

9、04800、1∶204800、1∶819200;
　　D.首次免疫后第3周、第5周、第7周、第15周、第31周和第35周，pORF2aa422～637免疫小鼠所得血清用p166檢測(cè)，抗-HEV IgG抗體滴度分別為1∶6400、1∶204800、1∶819200、1∶204800、1∶204800、1∶1638400;用p179檢測(cè)，抗體滴度分別為1∶3200、1∶102400、1∶819200、1∶204800、1∶204800

10、、1∶1638400;用pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660檢測(cè)，抗體滴度相同均分別為1∶6400、1∶204800、1∶819200、1∶204800、1∶204800、1∶819200;
　　E.首次免疫后第3周、第5周、第7周、第15周、第31周和第35周，pORF2aa430～660免疫小鼠所得血清用p166檢測(cè)，抗-HEV IgG抗體滴度分別為1∶6400、1∶4096

11、00、1∶819200、1∶204800、1∶204800、1∶819200;用p179檢測(cè)，抗體滴度分別為1∶3200、1∶102400、1∶409600、1∶204800、1∶204800、1∶819200;用pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660檢測(cè)，抗體滴度相同均分別為1∶6400、1∶204800、1∶409600、1∶204800、1∶204800、1∶409600。

12、　　F.運(yùn)用生物信息學(xué)分析軟件，對(duì)p166、p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660的中和抗原表位的突出情況作了分析，結(jié)果顯示5種蛋白的中和抗原表位突出面積分別為12.93,12.01,9.681,11.24以及9.372，此數(shù)據(jù)說(shuō)明五種蛋白天然二聚體狀態(tài)下p166突出程度最明顯，pORF2aa430～660突出程度最弱，可以部分解釋p166的抗原性優(yōu)于其他4種截短蛋白的原因。<

13、br>　　綜合上述研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)在相同的免疫時(shí)間點(diǎn)，pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660免疫小鼠的血清滴度明顯高于p166、p179的血清滴度，說(shuō)明長(zhǎng)片段蛋白的免疫原性明顯好于短片段蛋白。此外，同一份血清，在相同滴度下，用p166包被檢測(cè)所得OD值的平均值大于其他4種蛋白所檢測(cè)的OD值的平均值，經(jīng)t檢驗(yàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示p166的抗原性強(qiáng)于其他4種蛋白。
　　三.p16

14、6、p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660免疫血清的HEV中和作用
　　本實(shí)驗(yàn)采用基于PCR的HEV體外中和試驗(yàn)，來(lái)評(píng)價(jià)p166、p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660免疫小鼠血清的中和活性。結(jié)果如下:
　　A.p166、p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637和pORF2aa4

15、30～660的小鼠免疫血清均有中和作用，其中和效價(jià)分別為1∶8、1∶8、1∶80、1∶80和1∶4。pORF2aa439～660，pORF2aa422～637免疫血清中和效價(jià)最高，pORF2aa430～660免疫血清中和效價(jià)最低。
　　結(jié)論:
　　1.在p179的基礎(chǔ)上進(jìn)行N端和C端的延長(zhǎng)，能夠獲得包含更多抗原表位的、具有良好可溶性的、并可以二聚體形式出現(xiàn)的HEV pORF2截短蛋白;
　　2.新的截短蛋白pORF2a

16、a439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660和p166、p179進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，5種蛋白均具有良好的免疫原性和抗原性，pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660免疫原性優(yōu)于p166和p179，而p166的抗原性優(yōu)于pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660和p179;
　　3.pORF2aa439～660、pO