LTβR活化對(duì)膀胱癌細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路和細(xì)胞增殖水平的影響.pdf

1、目的:
　　炎癥和腫瘤之間的相互作用一直是關(guān)注的焦點(diǎn)，前期研究表明，膀胱癌組織內(nèi)存在大量淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，提示炎癥與膀胱癌之間存在密切聯(lián)系。已有研究表明，淋巴毒素β受體(Lymphotoxinβ receptor，LTβR)在多種腫瘤中廣泛表達(dá)，且活化的LTβR可激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖水平和腫瘤炎性微環(huán)境的形成過(guò)程。然而LTβR信號(hào)活化在不同腫瘤中的作用效果不一

2、致，且其在膀胱癌中的作用尚未闡明。因此本研究以人膀胱癌細(xì)胞株5637為研究對(duì)象，采用特異性配體淋巴毒素α1β2(Lymphotoxinα1β2，LTα1β2)激活LTβR信號(hào)和小發(fā)夾RNA(small hair RNA，shRNA)干擾LTβR表達(dá)的方式，旨在:
　　1、探討LTβR的活化對(duì)膀胱癌細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路主要成員RelA/p65、RelB mRNA表達(dá)水平、活化狀態(tài)的影響及其在膀胱癌炎性微環(huán)境形成過(guò)程中的作用。

3、r>　　2、探討LTβR的活化對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖水平的影響。
　　方法:
　　1、LTβR的激活試驗(yàn):利用特異性配體LTα1β2作用于人膀胱癌細(xì)胞5637，誘導(dǎo)LTβR活化，分組為:未激活組和LTα1β2激活組。①實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路成員RelA、RelBmRNA，細(xì)胞因子淋巴毒素α(Lymphotoxinα，LTα)、淋巴毒素β(Ly

4、mphotoxinβ, LTβ)、LIGHT(lymphotoxin-like, exhibits inducible expression and competes withherpes simplex virus glycoprotein Dfor herpes virus entry mediator,a receptorexpressed by T lymphocytes)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis fact

5、orα，TNFα)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β) mRNA，增殖相關(guān)基因細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)、生存素(Survivin) mRNA的表達(dá)水平變化;②蛋白免疫印跡(Western Blot，WB)檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路p65蛋白536絲氨酸(ser536)位點(diǎn)磷酸化水平(p-p65)的改變;③CCK-8(cell counting kit-8

6、)法檢測(cè)細(xì)胞增殖水平變化。
　　2、LTβR shRNA干擾試驗(yàn):采用脂質(zhì)體介導(dǎo)將LTβR shRNA干擾質(zhì)粒（shRNA1、2、3）及陰性shRNA質(zhì)粒(shRNA-NC)轉(zhuǎn)染入人膀胱癌細(xì)胞株5637，干擾LTβR的表達(dá)，轉(zhuǎn)染分組為:shRNA1組、shRNA2組、shRNA3組、shRNA-NC組，采用qRT-PCR和WB方法從mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)干擾質(zhì)粒對(duì)LTβR表達(dá)水平的影響，計(jì)算干擾效率，確定最優(yōu)干擾序列(shRN

7、A-optimal)。
　　3、低水平LTβR細(xì)胞的激活實(shí)驗(yàn):前期通過(guò)shRNA-optimal干擾明顯降低LTβR表達(dá)后，加入特異性配體LTα1β2誘導(dǎo)LTβR活化，實(shí)驗(yàn)分組為:shRNA-optimal激活組、shRNA-NC激活組，①qRT-PCR檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路RelA、RelB mRNA，細(xì)胞因子LTα、LTβ、TNFα、IL-6、IL-1β mRNA，增殖相關(guān)基因CyclinD1、Survivin mRNA的表達(dá)

8、水平變化;②CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性的變化。
　　結(jié)果:
　　1、LTβR的激活試驗(yàn):相對(duì)于未激活組（濃度為0），LTα1β2激活組中，①不同濃度(50、100、150、200ng/ml)LTα1β2誘導(dǎo)LTβR活化后均可促使RelA mRNA表達(dá)上調(diào)（P均＜0.05），以100ng/ml LTα1β2的上調(diào)效果最明顯，可高達(dá)2.5倍，但不同濃度之間RelA mRNA的表達(dá)并未見(jiàn)顯著性差異（P=0.244），RelB m

9、RNA的表達(dá)水平在誘導(dǎo)后表達(dá)有升高的趨勢(shì)，但未見(jiàn)顯著性差異（P均＞0.05）;②WB結(jié)果顯示100ng/ml LTα1β2誘導(dǎo)5min、15min后p-p65蛋白出現(xiàn)升高的趨勢(shì)（P均＞0.05）;③細(xì)胞因子TNFα、IL-1β mRNA表達(dá)分別上調(diào)5倍和1.5倍(P分別為0.034、0.013)，而LTα、 LTβ、IL-6 mRNA表達(dá)均未見(jiàn)差異性改變(P均＞0.05)，且在膀胱癌細(xì)胞內(nèi)并未檢測(cè)到LIGHT mRNA的表達(dá);④細(xì)胞增殖

10、相關(guān)基因CyclinD1、Survivin mRNA表達(dá)分別上調(diào)2.7和1.3倍(P分別為0.002、0.035);⑤在LTα1β2刺激膀胱癌細(xì)胞24h、48h后，細(xì)胞增殖活性分別為(97.73±4.57)％、(98.11±4.62)％，均未見(jiàn)明顯的變化（P均＞0.05）
　　2、LTβR shRNA干擾效率:qRT-PCR顯示，與shRNA-NC組相比，shRNA1組膀胱癌細(xì)胞LTβR mRNA表達(dá)下降65％～75％(P=0.0

11、01)，而shRNA2和shRNA3組分別降低51～61％和27～33％（P分別為0.003、0.006），因此選取shRNA1干擾序列作為最優(yōu)干擾序列shRNA-optimal，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。WB結(jié)果顯示，shRNA1干擾5637細(xì)胞72h后，LTβR蛋白表達(dá)下調(diào)50％(P＜0.001)。
　　3、低水平LTβR細(xì)胞的激活實(shí)驗(yàn):與shRNA-NC激活組相比，shRNA-optimal激活組，①NF-κB經(jīng)典通路的RelA m

12、RNA表達(dá)水平為對(duì)照組的2/3（P=0.012），而RelB mRNA的表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05）;②細(xì)胞因子TNFα、IL-1β mRNA表達(dá)分別下調(diào)27％和26％（P均為0.011），而其他細(xì)胞因子的表達(dá)并未受到顯著的影響（P均＞0.05）;③細(xì)胞增殖相關(guān)基因CyclinD1、Survivin mRNA分別下調(diào)50％和38％（P分別為0.009、0.008）;④在LTα1β2刺激24h和48h后，細(xì)胞增殖活性分別為(108.19