NF-κB信號通路在放射線誘導的腺樣囊性癌細胞凋亡中的實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　 唾液腺腺樣囊性癌(adenoidcysticcarcinomaofsalivaryglands，ACCs)是常見的涎腺上皮來源的惡性腫瘤，其具有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低，而嗜神經(jīng)性侵襲和遠處轉(zhuǎn)移率高兩大生物學特性，其局部神經(jīng)侵襲和10年遠處轉(zhuǎn)移分別高達50％和30-40％，單純手術(shù)治療往往不能根治腫瘤[1]。對于腫瘤大于4cm、臨床分期晚期（Ⅲ期或Ⅳ期）及有神經(jīng)侵犯者施行術(shù)后放療，可在一定程度上降低腫瘤的局部復發(fā)率[

2、2]]，但效果不盡如人意。因此如何利用基因治療的方法，提高唾液腺腺樣囊性癌對放射治療的敏感性，從而提高腺樣囊性癌的局部控制率和遠處轉(zhuǎn)移率，進一步提高晚期惡性腫瘤的治療的成功率和患者的生存質(zhì)量成為現(xiàn)階段國內(nèi)外相關(guān)研究的熱點。由于NF-κB信號通路的持續(xù)性激活在腫瘤細胞的抗凋亡機制中發(fā)揮重要的作用[3]，與腫瘤細胞的放射抵抗作用密切相關(guān)，因此，通過基因工程技術(shù)抑制此通路或許可以顯著提高腫瘤的放療敏感性，從而提高腺樣囊性癌的放射治療療效。

3、r>　　 研究目的:
　　 對腺樣囊性癌細胞通過瞬時轉(zhuǎn)染導入IκBα-M的基因，將轉(zhuǎn)染后的ACC-2細胞進行6種劑量(0、2、4、6、8、10Gy)的高能X線照射，在照射后不同時間點(1、3、6、10、24、48h)應用免疫細胞化學檢測ACC-2細胞NF-κBp65的核內(nèi)移位情況，應用Westernblot技術(shù)定量檢測各個時間點NF-κBp65的蛋白表達情況，同時采用流式細胞術(shù)和原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)(terminaldeox

4、ynucleotidyltransferase-mediateddUTP-biotinnickendlabelingassay，TUNEL)檢測相應時間點細胞的凋亡情況，探討NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路在放射線誘導的人唾液腺腺樣囊性癌ACC-2細胞凋亡中的變化規(guī)律。為進一步的動物實驗和臨床應用提供細胞學實驗基礎。
　　 實驗方法:
　　 實驗采用腺樣囊性癌ACC-2細胞系，于37℃恒溫下于5％CO2、飽和濕度的孵箱中進行細胞培

5、養(yǎng)，傳代細胞。待細胞長至對數(shù)生長期后，采用脂質(zhì)體2000將pBabe-SR-IκBa質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染入ACC-2細胞，Westernblot法檢測轉(zhuǎn)染后IκBa蛋白表達的變化，將轉(zhuǎn)染后的ACC-2細胞進行6種劑量(0、2、4、6、8、10Gy)的高能X線照射，在照射后不同時間點(1、3、6、10、24、48h)應用免疫細胞化學檢測ACC-2細胞NF-κBp65的表達情況，應用ImagePro-Plus圖像分析軟件測其細胞核平均灰度值，應用W

6、esternblot技術(shù)定量分析NF-κBp65蛋白表達的變化。并同時應用流式細胞術(shù)（Flowcytometricanalysis）和原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)(terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTP-biotinnickendlabelingassay，TUNEL)檢測不同時間點和劑量組的細胞凋亡率。以上各實驗步驟統(tǒng)一細胞生長的外環(huán)境，并設置轉(zhuǎn)染pBabe空白質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組，

7、關(guān)鍵步驟重復兩遍以減少系統(tǒng)誤差，并用SPSS16.0軟件對數(shù)據(jù)進行檢驗分析。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1.與轉(zhuǎn)染pBabe空白質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組比較，轉(zhuǎn)染pBabe-SR-IκBa質(zhì)粒ACC-2細胞不僅表達內(nèi)源性IκBa，同時也表達SR-IκBa;接受相同放射線劑量照射后3h細胞核平均灰度值升高(P＜0.05)。
　　 2.SR-IκBa質(zhì)粒組中，免疫組化實驗顯示不同劑量組的細胞核平均灰度值均低于0Gy組，We

8、sternblot技術(shù)顯示各個劑量組的p65蛋白表達均高于0Gy組。與此相對應的是，流式細胞術(shù)(Flowcytometricanalysis)和原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)(TUNEL)顯示細胞接受各個劑量放射治療后的細胞凋亡率均高于未接受放療的0Gy組。
　　 3.免疫組化實驗和Westernblot技術(shù)顯示，約在接受照射后6-10h，細胞核平均灰度值達到最低值，此時細胞內(nèi)NF-κBp65蛋白的表達量達到峰值;相同時間點上，3h組細

9、胞細胞核平均灰度值隨放射劑量增加而降低，細胞內(nèi)NF-κBp65蛋白的表達量也隨著放射劑量的增大而增加(P＜0.05)。
　　 4.流式細胞術(shù)(Flowcytometricanalysis)和原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)(TUNEL)顯示轉(zhuǎn)染目的基因后，接受放療的細胞的凋亡率隨NF-κBp65蛋白的表達量增加而表現(xiàn)為相反的趨勢，即照射后6-10h細胞的凋亡率達到最低值，3h組細胞的凋亡率隨照射劑量的增加而降低。
　　 研究結(jié)論: