基于Semliki Forest甲病毒復(fù)制子的弓形蟲NTPase-Ⅱ核酸疫苗的免疫保護(hù)性研究.pdf

1、弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種常見的機(jī)會(huì)性致病原蟲，普遍寄生于人和多種動(dòng)物的有核細(xì)胞內(nèi)，可引起人獸共患弓形蟲病，對孕婦或免疫缺陷患者（如器官移植、艾滋病及惡性腫瘤患者）造成嚴(yán)重的威脅。研制安全、高效、廉價(jià)的疫苗被認(rèn)為是弓形蟲防治的重要措施。核酸疫苗作為第三代疫苗，具有制備簡單、能誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答等優(yōu)勢。基于甲病毒復(fù)制子設(shè)計(jì)的核酸疫苗，包括自主復(fù)制型RNA疫苗和自殺性DNA疫苗，利用甲病毒復(fù)制子的自主復(fù)制功能

2、，在宿主細(xì)胞中高水平表達(dá)插入的外源抗原基因，而且能夠宿主細(xì)胞的凋亡，呈現(xiàn)出比常規(guī)的核酸疫苗更好的應(yīng)用前景。弓形蟲核苷三磷酸脫氫酶Ⅱ(nucleosidetriphosphate hydrolaseⅡ，NTPase-Ⅱ)是分布于弓形蟲速殖子表面的一種主要特異性抗原，對蟲體在宿主細(xì)胞內(nèi)的寄生和繁殖都具有重要的作用。本研究構(gòu)建基于Semliki Forest Virus(SFV)甲病毒復(fù)制子的弓形蟲NTPase-Ⅱ自主復(fù)制型RNA疫苗和自殺性

3、DNA疫苗，評價(jià)它們在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答及其抗弓形蟲的免疫保護(hù)作用，為弓形蟲新型核酸疫苗的研制提供新型載體。
　　目的：
　　1.制備基于SFV甲病毒復(fù)制子的弓形蟲NTPase-Ⅱ自主復(fù)制型RNA疫苗和自殺性DNA疫苗;
　　2.評價(jià)弓形蟲NTPase-Ⅱ自主復(fù)制型RNA疫苗和自殺性DNA疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)和免疫保護(hù)性，為弓形蟲核酸疫苗的研制提供新型載體。
　　方法：
　　1.弓形蟲N

4、TPase-Ⅱ自主復(fù)制型RNA疫苗和自殺性DNA疫苗的制備
　　從弓形蟲RH株基因組中擴(kuò)增到NTPase-Ⅱ基因，分別插入到兩個(gè)基于SFV甲病毒復(fù)制子疫苗載體pRREP-eGFP和pDREP-eGFP構(gòu)建重組質(zhì)粒pRREP-NTPase-Ⅱ和pDREP-NTPase-Ⅱ。將pRREP-NTPase-Ⅱ質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄和加帽制備弓形蟲NTPase-Ⅱ自主復(fù)制型RNA疫苗，大量提取pDREP-NTPase-Ⅱ質(zhì)粒并純化制備弓形蟲NTPas

5、e-Ⅱ自殺性DNA疫苗。
　　2.弓形蟲NTPase-Ⅱ自主復(fù)制型RNA疫苗和自殺性DNA疫苗的體外鑒定
　　采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將制備的弓形蟲NTPase-Ⅱ自主復(fù)制型RNA疫苗和自殺性DNA疫苗分別轉(zhuǎn)染人源胚胎腎細(xì)胞293T，經(jīng)間接免疫熒光技術(shù)IFA檢測插入的抗原基因NTPase-Ⅱ能否在293T細(xì)胞中的表達(dá)。
　　3.弓形蟲NTPase-Ⅱ自主復(fù)制型RNA疫苗和自殺性DNA疫苗對小鼠的免疫保護(hù)作用及其機(jī)制研究

6、>　　將制備的弓形蟲NTPase-Ⅱ自主復(fù)制型RNA疫苗pRREP-NTPase-Ⅱ和自殺性DNA疫苗pDREP-NTPase-Ⅱ，采用肌肉注射聯(lián)合瞬時(shí)電穿孔的方式分別免疫BALB/c小鼠，以pRREP-eGFP和pDREP-eGFP分別作為各自的疫苗對照，以PBS作為空白對照。ELISA法檢測免疫小鼠血清中特異性的總IgG抗體及IgG1和IgG2a抗體亞類，評價(jià)誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)水平;CCK-8法檢測免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，ELISA

7、法檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌的4種細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的含量，流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，評價(jià)誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng);對免疫小鼠腹腔注射弓形蟲強(qiáng)毒株RH株速殖子進(jìn)行急性攻擊感染記錄各組小鼠的生存時(shí)間，對免疫小鼠灌胃感染弓形蟲成囊株P(guān)ru株進(jìn)行慢性感染5周后計(jì)算各組小鼠腦組織中的包囊數(shù)，來評價(jià)疫苗對免疫小鼠抗弓形蟲感染的免疫保護(hù)作用。
　　結(jié)果：
　　1.從弓形蟲

8、RH株基因組中擴(kuò)增到NTPase-Ⅱ基因，經(jīng)測序鑒定成功構(gòu)建了兩個(gè)基于SFV甲病毒復(fù)制子的弓形蟲NTPase-Ⅱ核酸疫苗載體pRREP-NTPase-Ⅱ和pDREP-NTPase-Ⅱ，制備了弓形蟲NTPase-Ⅱ自主復(fù)制型RNA疫苗和自殺性DNA疫苗;
　　2.將制備的弓形蟲NTPase-Ⅱ自主復(fù)制型RNA疫苗pRREP-NTPase-Ⅱ和自殺性DNA疫苗pDREP-NTPase-Ⅱ分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，用NTPase-Ⅱ單抗經(jīng)I

9、FA檢測NTPase-Ⅱ蛋白的表達(dá)。與對照組相比，轉(zhuǎn)染NTPase-Ⅱ核酸疫苗的細(xì)胞檢測到特異性的綠色熒光，表明制備的弓形蟲NTPase-Ⅱ核酸疫苗能夠介導(dǎo)外源插入的NTPase-Ⅱ抗原基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)成蛋白;
　　3.將弓形蟲NTPase-Ⅱ自主復(fù)制型RNA疫苗pRREP-NTPase-Ⅱ和自殺性DNA疫苗pRREP-NTPase-Ⅱ分別免疫BALB/c小鼠。與對照組相比，ELISA法檢測到免疫組小鼠血清中IgG抗體及I

10、gG1和IgG2a顯著升高，且IgG2a/IgG1＞1，pDREP-NTPase-Ⅱ比pRREP-NTPase-Ⅱ誘導(dǎo)了更高水平的體液免疫應(yīng)答;ELISA法檢測到免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10細(xì)胞因子濃度均顯著升高，且IFN-γ濃度高水平升高，IL-4濃度低水平升高;經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析，免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD3+CD8+雙陽性T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著增長，而CD3+CD4+雙陽性T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)無顯著變化;急

11、性攻擊感染的免疫組小鼠的生存時(shí)間顯著延長;慢性攻擊感染，免疫組小鼠腦組織中的Pru包囊數(shù)大大下降，減蟲率均達(dá)80％以上。以上結(jié)果表明，弓形蟲NTPase-Ⅱ核酸疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Th1/Th2混合型并以Th1型為主的免疫反應(yīng)，對弓形蟲的急性感染和慢性感染都起到顯著的免疫保護(hù)作用。弓形蟲NTPase-Ⅱ自殺性DNA疫苗與自主復(fù)制型RNA疫苗與相比，除了誘導(dǎo)更強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答，兩者在細(xì)胞免疫和免疫保護(hù)性方面基本沒有顯著性的差異。
　　結(jié)