弓形蟲致密顆?？乖璆RA7疫苗初免-加強(qiáng)免疫策略增強(qiáng)小鼠抗弓形蟲感染的免疫保護(hù)性研究.pdf

1、弓形蟲是一種細(xì)胞內(nèi)寄生的原蟲，可感染包括人在內(nèi)所有溫血脊椎動物的有核細(xì)胞，引起人獸共患弓形蟲病，嚴(yán)重威脅著人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)。目前為止，尚無有效的治療藥物。鑒于疫苗防治多種疾病的經(jīng)驗，研制安全有效的抗弓形蟲疫苗不失為一種具有潛力的防治措施。為此，本研究制備了弓形蟲致密顆?？乖璆RA7的DNA疫苗和蛋白疫苗，將其接種于BALB/c小鼠，評價疫苗的免疫效果，并觀察異質(zhì)性prime-boost免疫策略對小鼠免疫應(yīng)答的影響，為研制安全有效的弓

2、形蟲疫苗及優(yōu)化免疫方案奠定基礎(chǔ)。
　　 目的:
　　 構(gòu)建編碼弓形蟲致密顆粒抗原GRA7的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-GRA7和原核表達(dá)質(zhì)粒pET30-GRA7，分別制備弓形蟲GRA7的DNA疫苗和蛋白質(zhì)疫苗，評價疫苗的免疫效果，觀察prime-boost免疫策略對小鼠免疫應(yīng)答的影響。
　　 方法:
　　 采用PCR技術(shù)從弓形蟲基因組DNA中擴(kuò)增弓形蟲致密顆?？乖璆RA7基因，回收PCR產(chǎn)物，將其連接至克隆載

3、體pEASY-T1中，構(gòu)建克隆載體pEASY-GRA7，分別進(jìn)行菌落PCR、酶切和測序鑒定。采用亞克隆技術(shù)將GRA7基因分別克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-C(1)和原核表達(dá)載體pET-30a(+)中，分別構(gòu)建能表達(dá)GRA7的重組真核表達(dá)載體pEGFP-GRA7和重組原核表達(dá)載體pET30-GRA7，并對它們進(jìn)行鑒定。將pEGFP-GRA7轉(zhuǎn)染HFF細(xì)胞，經(jīng)熒光顯微鏡觀察、SDS-PAGE和Westernblotting分析、鑒定后，大量

4、提取重組質(zhì)粒pEGFP-GRA7用于制備弓形蟲GRA7DNA疫苗。將pET30-GRA7轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，采用鎳柱親和層析法純化GRA7蛋白，SDS-PAGE和Westernblotting分析鑒定后，制備弓形蟲GRA7重組蛋白疫苗。動物實(shí)驗觀察疫苗的免疫效果，同時評價異質(zhì)性prime-boost免疫策略對BALB/c小鼠免疫應(yīng)答的影響。
　　 結(jié)果:
　　 經(jīng)PCR體外擴(kuò)增獲得GRA7基因

5、片段，大小為708bp。重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-GRA7經(jīng)菌落PCR、雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在708bp處有一特異性條帶，與預(yù)期GRA7目的基因片段大小一致;DNA測序結(jié)果顯示目的基因片段GRA7準(zhǔn)確插入真核表達(dá)質(zhì)粒中。pEGFP-GRA7轉(zhuǎn)染的HFF細(xì)胞經(jīng)熒光顯微鏡觀察、SDS-PAGE和Westernblotting分析，均能檢測到GRA7蛋白的表達(dá)。重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET30-GRA7經(jīng)菌落PCR、雙酶切鑒定，瓊脂

6、糖凝膠電泳結(jié)果顯示在708bp處有一特異性條帶，與預(yù)期GRA7目的基因片段大小一致;DNA測序結(jié)果顯示目的基因片段GRA7準(zhǔn)確插入原核表達(dá)質(zhì)粒中。pET30-GRA7轉(zhuǎn)入EcoliBL21誘導(dǎo)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Westernblotting分析，可檢測到GRA7蛋白的表達(dá)。采用異質(zhì)性prime-boost免疫策略接種BALB/c小鼠，其中DNA疫苗初免-蛋白加強(qiáng)免疫組小鼠抗弓形蟲IgG、IgG2a和IFN-γ水平均高于其它實(shí)驗組(