弓形蟲自殺性DNA疫苗及重組桿狀病毒疫苗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)廣泛存在于世界各地,寄生于人和200多種脊椎動物的有核細胞內(nèi)而引起人獸共患弓形蟲病(Toxoplasmosis)。該病嚴重影響人類優(yōu)生優(yōu)育與畜牧業(yè)的健康發(fā)展。目前弓形蟲病的防治主要依靠藥物防治,但藥物防治無法從根本上清除宿主體內(nèi)的弓形蟲,僅僅是將弓形蟲從快速繁殖的速殖子轉(zhuǎn)變?yōu)榫徛敝车木徶匙?一旦宿主的免疫功能出現(xiàn)障礙,弓形蟲將從緩殖子再度活化為速殖子。因此研制安全高效的新型疫苗來預防和控

2、制弓形蟲病成為各國研究者關注的焦點。但由于弓形蟲的生活史復雜,影響免疫的因素多,目前弓形蟲病的免疫預防研究進展不大。
   本研究對弓形蟲病兩種新型疫苗進行了探索,構建了“自殺性DNA疫苗”pSCA-MIC3和重組桿狀病毒疫苗Ac-V-MIC3、Ac-V-SAG1,并在實驗鼠模型BALB/c上對構建的候選疫苗進行了免疫效力研究,主要研究結(jié)果如下:
   1.弓形蟲“自殺性DNA疫苗”pSCA-MIC3的構建及免疫原性研究

3、
   DNA疫苗具有高效、穩(wěn)定、易構建等優(yōu)點被研究者認為是最有潛力的新型疫苗,但DNA疫苗免疫后長期存在于宿主體內(nèi),一旦整合進宿主染色體可能會引起宿主基因的改變,另外宿主體內(nèi)可能會產(chǎn)生針對該DNA疫苗的抗體,因此存在很大的安全隱患?;诩撞《緩椭谱拥淖詺⑿訢NA疫苗繼承了DNA疫苗的上述優(yōu)點,但它能隨宿主細胞的凋亡自我凋亡,同時具有免疫增強的作用,因此被認為是一種優(yōu)良的新型疫苗載體。
   本研究從弓形蟲全基因組中利用

4、PCR擴增弓形蟲MIC3全基因,并克隆到“自殺性DNA疫苗”質(zhì)粒載體pSAG1和常規(guī)DNA疫苗載體pcDNA3.1+中,獲得“自殺性DNA疫苗”pSCA-MIC3和常規(guī)DNA疫苗pcDNA-MIC3。間接免疫熒光實驗和RT-PCR檢測結(jié)果表明pSCA-MIC3和pcDNA-MIC3均能夠介導弓形蟲MIC3基因在BHK-21細胞中有效表達。將該疫苗與常規(guī)DNA疫苗pcDNA-MIC3分別以50ug和100ug免疫六周齡BALB/C鼠,試驗

5、結(jié)果表明,在首疫后兩周pSCA-MIC3、pcDNA-MIC3均能利用ELISA檢測到微弱的抗弓形蟲MIC3抗體,第四周,第六周加強免疫后兩組的抗體水平繼續(xù)升高,但pSCA-MIC3、pcDNA-MIC3兩組之間抗體水平差異不顯著,PBS和空載體對照組均檢測不到MIC3抗體的存在。細胞免疫水平檢測表明pSCA-MIC3、pcDNA-MIC3免疫組的BALB/c鼠誘導的淋巴細胞增殖、IFN-γ的表達均顯著高于PBS和空載體對照組,但pSC

6、A-MIC3、pcDNA-MIC3兩組之間細胞免疫水平差異不顯著。使用弓形蟲RH株攻擊時二者均能顯著延長BALB/c鼠的存活時間。以上研究結(jié)果表明“自殺性DNA疫苗”pSCA-MIC3具有良好的免疫原性,同時其隨宿主細胞自我凋亡的特性導致它比常規(guī)的DNA疫苗有著更高的安全性,是一種極具潛力的弓形蟲候選疫苗。
   2.弓形蟲重組桿狀病毒疫苗Ac-V-MIC3、Ac-V-SAG1的構建及免疫原性的研究
   在合適的啟動子

7、驅(qū)動下,桿狀病毒可以在多種哺乳動物細胞中表達外源基因,但自身并不感染哺乳動物細胞。但桿狀病毒介導外源基因表達的能力在一定程度上受到血清補體系統(tǒng)的抑制,從而影響桿狀病毒疫苗的應用。水泡性口炎病毒G蛋白的引入,可以消除桿狀病毒對補體的敏感性。因此利用哺乳動物極早期啟動子CMV驅(qū)動的,水泡性口炎病毒G蛋自修飾的桿狀病毒載體pFast-VSV-G-CMV(Ac-V)成為一種優(yōu)良的疫苗載體。
   本研究分別將弓形蟲的MIC3、SAG1基

8、因插入桿狀病毒載體pFast-VSV-G-CMV構建了重組桿狀病毒Ac-V-MIC3、Ac-V-SAG1。間接免疫熒光實驗表明重組桿狀病毒Ac-V-MIC3、Ac-V-SAG1均能高效轉(zhuǎn)導哺乳動物PK-15細胞。將重組桿狀病毒Ac-V-MIC3、Ac-V-SAG1分別以不同的劑量(1010pfu/mL,109pfu/mL,108pfu/mL)免疫BALB/c鼠,試驗結(jié)果表明,在首免后第三周,重組病毒Ac-V-MIC3、Ac-V-SAG1

9、免疫組和相應的DNA疫苗對應組均可檢測到特異的抗弓形蟲ELISA抗體,二次免疫之后,重組病毒Ac-V-MIC3、Ac-V-SAG1免疫組ELISA平均抗體水平隨之升高,均顯著的高于其它對照組。重組桿狀病毒Ac-V-MIC3、Ac-V-SAG1免疫組的細胞免疫水平同樣顯著高于對照組,重組病毒1010pfu/mL免疫組表現(xiàn)出最高的體液和細胞免疫水平,顯著高于108pfu/mL免疫組和DNA疫苗對照組。使用弓形蟲RH株攻擊時重組病毒1010p

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