弓形蟲(chóng)MORN1-2基因缺失株的構(gòu)建及其免疫保護(hù)性研究.pdf

1、剛地弓形蟲(chóng)（Toxoplasma gondii）是一種專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，可以感染幾乎所有的溫血?jiǎng)游?，引起?yán)重的弓形蟲(chóng)病癥，造成新生兒流產(chǎn)、死胎等。弱毒活疫苗對(duì)控制弓形蟲(chóng)的傳播有潛在價(jià)值，但報(bào)道甚少。MORN基因家族因參與速殖子細(xì)胞骨架的形成過(guò)程而發(fā)揮重要作用，是作為研制抗弓形蟲(chóng)弱毒活疫苗的理想候選基因。本研究的目的在于構(gòu)建弓形蟲(chóng)MORN1與MORN2基因缺失株，闡明MORN基因家族成員的在弓形蟲(chóng)中的生物學(xué)功能，評(píng)價(jià)它們作為弱毒活疫苗的

2、免疫保護(hù)力，探究其作為弱毒活疫苗的潛在價(jià)值。
　　首先，為研究MORN2基因的生物學(xué)功能是否與弓形蟲(chóng)的毒力相關(guān)，我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)，對(duì)弓形蟲(chóng)Ⅰ型RH蟲(chóng)株的MORN2基因進(jìn)行了敲除。利用同源重組，在基因缺失處插入乙胺嘧啶藥物抗性的片段DHFR。通過(guò)單克隆篩選以及PCR鑒定，成功獲得MORN2基因缺失株。對(duì)該缺失株進(jìn)行體外噬斑試驗(yàn)和體內(nèi)毒力試驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)MORN2基因的缺失幾乎不影響RH蟲(chóng)株在體外培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)速度和對(duì)小鼠

3、感染的毒力。因此我們認(rèn)為MORN2基因的缺失不影響弓形蟲(chóng)RH蟲(chóng)株的毒力，其缺失株不具備成為弱毒疫苗的可能性。
　　然后，為了研究△MORN1弱毒株作為弱毒疫苗的潛在可能性，我們又構(gòu)建了△MORN1缺失株，評(píng)價(jià)了該缺失株對(duì)小鼠的毒力影響。進(jìn)而以△MORN1缺失株腹腔接種昆明鼠，并在免疫后28d和70d檢測(cè)相應(yīng)的體液免疫和細(xì)胞免疫指標(biāo)變化情況。在免疫70d后進(jìn)行攻蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)，對(duì)免疫的小鼠通過(guò)腹腔注射的方式，分別感染RH、PYS及TgC7三

4、種不同蟲(chóng)株的速殖子103個(gè)（急性感染）或通過(guò)口服的萬(wàn)式感染PRU包囊20個(gè)（慢性感染），檢測(cè)小鼠的存活時(shí)間和包囊減少率。結(jié)果表明，經(jīng)△MORN1缺失株免疫的小鼠血清中抗體水平顯著升高，脾細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平顯著升高。在急性感染試驗(yàn)中，免疫鼠夠較好地抵御RH、PYS及TgC7三種蟲(chóng)株的感染。在慢性感染試驗(yàn)中，對(duì)PRU包囊造成的慢性感染有較好的保護(hù)作用，能夠有效減少小鼠腦中包囊數(shù)量。為了探究△MORN1缺失株對(duì)弓形蟲(chóng)垂直傳播（先天性感染）

5、的阻斷效果，分別在母鼠懷孕第12天和第18天時(shí)，口服感染PRU蟲(chóng)株的包囊10個(gè)或者腹腔注射RH蟲(chóng)株速殖子200個(gè)，觀察并記錄仔鼠存活數(shù)和體重變化。結(jié)果顯示經(jīng)△MORN1缺失株免疫的母鼠能夠明顯地提高仔鼠的存活率及體重，同時(shí)減少仔鼠腦中包囊數(shù)量?！鱉ORN1缺失株能夠?qū)π∈蟮募毙愿腥尽⒙愿腥炯跋忍煨愿腥揪哂斜Ｗo(hù)作用，因此有望成為防控弓形蟲(chóng)病的弱毒疫苗。
　　綜上所述，本研究通過(guò)構(gòu)建弓形蟲(chóng)Ⅰ型RH蟲(chóng)株的△MORN1與△MORN2缺失