扶正解毒方對(duì)荷瘤小鼠腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)下血管重塑的調(diào)控研究.pdf_第1頁(yè)
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1、胃癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是一直困擾臨床醫(yī)生和限制臨床療效提高的重要難題。近年來(lái)研究表明,腫瘤免疫抑制微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞賴以生存的基礎(chǔ),對(duì)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、逃避免疫監(jiān)視、形成微血管方面起著重要作用。已經(jīng)完成的國(guó)家自然基金課題(NO.81072802)扶正解毒法對(duì)HIF-α介導(dǎo)的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)促微淋巴管生成的調(diào)控研究顯示扶正解毒方可以誘導(dǎo)腫瘤間質(zhì)中的TAM向M1型轉(zhuǎn)化,逆轉(zhuǎn)腫瘤組織中的乏氧環(huán)境和免疫抑制狀態(tài),抑制微淋巴管的生成,其機(jī)制與干預(yù)P

2、I3K/AKT/mTOR通路有關(guān),同時(shí)發(fā)現(xiàn)扶正解毒方對(duì)移植瘤微血管生成亦有一定的調(diào)節(jié)作用。
  研究目的:
  本實(shí)驗(yàn)以此為基礎(chǔ),進(jìn)一步探討扶正解毒方對(duì)荷瘤小鼠模型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)下血管重塑的調(diào)控機(jī)制。
  研究方法:
  造模:建立移植性前胃癌小鼠荷瘤模型(參照國(guó)家自然基金項(xiàng)目NO.81072802),將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組、中藥組(扶正解毒方)、化療組(5-Fu)、中西醫(yī)結(jié)合組(結(jié)合組),分別給予相應(yīng)藥

3、物干預(yù)14天。作用觀察:觀察扶正解毒中藥對(duì)前胃癌小鼠荷瘤模型移植瘤的生長(zhǎng)及抑制情況,用超聲檢測(cè)小鼠移植瘤血管分布及血流參數(shù),采用尾靜脈注射熒光染料和腹腔注射乏氧探針的方法觀察腫瘤組織的血流灌注量和乏氧狀況。機(jī)制探討:用FACS法檢測(cè)各組小鼠CD4+/CD8+T細(xì)胞比值、Treg細(xì)胞含量,RT-PCR檢測(cè)血管生成因子VEGF、MMP-9、COX-2、及免疫抑制因子IL-6、1L-10,趨化因子CCL-17、Arg-1分泌水平,Wester

4、nblot和IHP法檢測(cè)血管生成素、UPR以及核心通路mTOR相關(guān)因子表達(dá)的情況。
  研究結(jié)果:
  1.荷瘤小鼠移植瘤的瘤重及抑制率
  對(duì)照組瘤重最高,為1.29±0.39g,藥物干預(yù)后,各治療組瘤重降低,中藥組、化療組、結(jié)合組的瘤重分別為0.93±0.37g、0.62±0.30g、0.48±0.24g;按照抑瘤率計(jì)算公式中藥組、化療組、結(jié)合組的瘤重抑制率分別為28.20%、52.09%、62.59%。
 

5、 2.超聲觀察各組小鼠腫瘤的血管分布及血流參數(shù)檢測(cè)
  對(duì)照組腫瘤組織血流豐富,血管密集、雜亂地分布于腫瘤周邊,管徑較細(xì),缺少典型、深入瘤體中心的較大血管。中藥組腫瘤組織血流豐富程度不及對(duì)照組,然而其血管集中、規(guī)則,往往有1~2個(gè)深入瘤體中心的較大血管?;熃M、結(jié)合組也有部分集中深入瘤體內(nèi)部的血管,但血管普遍較少,血流信號(hào)不明顯。各組小鼠瘤內(nèi)血流參數(shù)PSV、EDV、RI值均為:中藥組>對(duì)照組>化療組>結(jié)合組。各組小鼠瘤體內(nèi)血管Al

6、der分級(jí)程度亦與血流參數(shù)情況類似,中藥組分級(jí)程度最高,其次分別為對(duì)照組、化療組、結(jié)合組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
  3.腫瘤組織內(nèi)的血流灌注及乏氧狀況
  腫瘤組織內(nèi)的血流灌注量依次為對(duì)照組>中藥組>化療組>結(jié)合組。其乏氧嚴(yán)重程度亦為對(duì)照組>中藥組>化療組>結(jié)合組,對(duì)照組乏氧情況最嚴(yán)重,藥物干預(yù)后,治療組乏氧狀況輕度改善。
  4.對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞免疫抑制微環(huán)境的影響
  對(duì)照組腫瘤組織CD4+/CD8+T細(xì)胞比

7、值為1.45±0.09,處于一個(gè)較低的水平,而脾組織Treg細(xì)胞的相對(duì)含量較高(2.50±0.56),且高表達(dá)M2型巨噬細(xì)胞的特征性免疫抑制因子IL-6、IL-10和趨化因子CCL-17、Arg-1,提示腫瘤微環(huán)境處于免疫抑制狀態(tài)。扶正解毒中藥干預(yù)后,腫瘤微環(huán)境CD4+/CD8+T細(xì)胞比值得到一定程度的提高(1.72±0.14),聯(lián)合化療組(1.96±0.31)效果最為明顯;Treg細(xì)胞含量降低,中藥組、化療組、結(jié)合組分別為1.37±0

8、.44、1.67±0.20、1.15±0.55,免疫抑制因子表達(dá)水平也降低。
  5.對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞促血管生成因子表達(dá)的影響
  移植瘤中對(duì)照組VEGFa、MMP-9、COX-2基因的轉(zhuǎn)錄水平最高,經(jīng)藥物治療后,各組目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄水平均有降低趨勢(shì),P<0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,結(jié)合組降低效果最為明顯。VEGFa基因表達(dá)水平為對(duì)照組>化療組>中藥組>結(jié)合組;MMP-9、COX-2基因表達(dá)水平為對(duì)照組>中藥組>化療組>結(jié)合

9、組,MMP-9基因表達(dá)水平結(jié)合組與中藥組、化療組相比,降低水平明顯,而COX-2為化療組、結(jié)合組的基因表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組、中藥組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
  對(duì)照組移植瘤高表達(dá)Ang-1、Ang-2,經(jīng)藥物治療后其蛋白表達(dá)水平均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ang-1蛋白的表達(dá)水平為對(duì)照組>中藥組>化療組>結(jié)合組,其中結(jié)合組與中藥組、化療組相比,差異顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;對(duì)照組Ang-2蛋白表達(dá)水平最高,經(jīng)藥物治療后各治療組蛋白表達(dá)水平降

10、低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而各治療組之間相互比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
  6.對(duì)Rheb/mTOR/p70S6K1信號(hào)通路的調(diào)控
  對(duì)照組高表達(dá)PI3K、Rheb、p70S6K1蛋白,中藥干預(yù)后,PI3K、Rheb表達(dá)水平降低,結(jié)合組降低最為明顯,對(duì)照組與各治療組之間,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。p70S6K1蛋白中藥組和結(jié)合組有降低的趨勢(shì),與對(duì)照組相比,僅結(jié)合組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
  對(duì)照組mTOR、AKT、TSC1蛋白的光密度

11、值較高,藥物干預(yù)后表達(dá)水平降低。與對(duì)照組相比,mTOR蛋白中藥組和結(jié)合組的的光密度值降低明顯;AKT蛋白結(jié)合組光密度值最低,與對(duì)照組、中藥組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;中藥組、化療組TSC1蛋白光密度值較對(duì)照組降低,結(jié)合組最少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
  7.對(duì)腫瘤微環(huán)境中非折疊蛋白反應(yīng)(UPR)的調(diào)控
  對(duì)照組GRP-78蛋白表達(dá)水平較高,經(jīng)藥物干預(yù)后其表達(dá)水平降低,各治療組與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;化療組GRP-78的表

12、達(dá)水平最低,但各治療組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
  ATF-6、IRE1α、PERK對(duì)照組的光密度值最高,藥物干預(yù)后降低。ATF-6、IRE1α蛋白結(jié)合組的光密度值最低,各治療組與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;PERK蛋白經(jīng)中藥干預(yù)后,蛋白的光密度值降低,聯(lián)合化療未見(jiàn)效果更為明顯。
  研究結(jié)論:
  扶正解毒中藥能有效抑制前胃癌荷瘤小鼠模型移植瘤的生長(zhǎng),減少腫瘤血管生成,同時(shí)促進(jìn)腫瘤局部的血流灌注,改善腫瘤微環(huán)境的乏氧

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