Locostation對肝纖維化小鼠肝臟膠原代謝的影響.pdf

1、肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是由各種致病因子如病毒、酒精、化學(xué)藥物等引起慢性肝細胞損傷，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度沉積，纖維結(jié)締組織異常增生的一個病理過程。肝纖維化是肝炎發(fā)展為肝硬化、肝癌的必經(jīng)階段，因此預(yù)防、治療甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化成為慢性肝病研究的重點。
　　肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)與肝纖維化的形成密切相關(guān)，當肝臟受到損傷

2、刺激時，靜止狀態(tài)的HSCs轉(zhuǎn)化為激活狀態(tài)的肌成纖維細胞樣細胞（myofibroblast cells，MFCs），引起ECM合成及降解異常，導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)和功能的改變。ECM的主要成份是膠原，在肝纖維化中主要以Ⅰ、Ⅲ型膠原明顯增加為主。膠原代謝受到基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor ofmetalloproteinases，TIMPs)的調(diào)節(jié)

3、。因此HSCs的活化是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。
　　肝纖維化的形成伴隨著Raf-1/MEK/ERK1，2信號通路的激活，該通路的激活可以促進HSCs的增殖、分化和遷移。Raf激酶抑制蛋白(raf kinaseinhibitor protein，RKIP)是磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白家族(phosphatid-ylethanolalmine binding proteins，PEBPs)中的成員，從植物到哺乳動物都有發(fā)現(xiàn)，可以調(diào)節(jié)多種信號

4、通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。RKIP與Raf-1激酶域相互作用，抑制Raf-1/MEK/ERK1，2信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。而RKIP的過表達可以促進HSCs的遷移。Locostatin是一種無抗菌活性的黃惡唑酮衍生物，是RKIP特異性抑制劑。本論文應(yīng)用四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)誘導(dǎo)小鼠肝纖維化形成，并通過腹腔注射Locostatin進行干預(yù)，旨在研究Locostatin對小鼠肝纖維化的影響及其作用機制。
　　目的:

5、CCl4誘導(dǎo)小鼠肝臟纖維化過程中，腹腔注射RKIP特異性抑制劑Locostatin進行干預(yù)，通過對肝臟炎癥及纖維化指標的檢測，研究Locostatin能否延緩肝纖維化的進展，甚至預(yù)防、阻止肝纖維化形成。
　　方法:將27只小鼠隨機分為正常對照組，模型組，治療組。治療組在CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型過程中，通過腹腔注射Locostatin進行干預(yù)。通過檢測血清中谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，AL

6、T)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）的水平及肝臟組織HE染色來研究肝臟炎癥程度的變化，通過血清羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)及肝臟組織Masson、苦味酸-天狼星紅染色研究膠原的變化。通過實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(reverse transcription quantitative PCR，RT-qRCR)分析Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、MMP-13、MMP-2、TIMP-

7、1、TIMP-2、RKIP及α-SMA基因水平的表達。通過免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)及western blot方法分析Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、α-SMA及RKIP蛋白的表達。運用酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)測定MMP-13、MMP-2、TIMP-1及TIMP-2蛋白的表達量。
　　結(jié)果:
　　1、Locostati

8、n可以抑制炎癥反應(yīng)，減少HSCs活化及膠原沉積:在HE染色中模型組炎癥重于治療組，正常對照組無炎癥反應(yīng)。在Masson染色及苦味酸-天狼星紅染色中模型組膠原含量多于治療組，正常對照組未見膠原在異常部位的沉積。IHC中模型組Ⅰ、Ⅲ型膠原及α-SMA的表達多于治療組，正常對照組表達最少。Ⅳ型膠原在模型組表達量最低，治療組表達量最高。模型組ALT（189.43±64.25）水平明顯高于(P＜0.01)正常對照組（8.06±4.46）及治療組（

9、61.88±5.40）水平，正常對照組與治療組無顯著性差異(P＞0.05)。模型組AST（231.15±39.86）水平明顯高于（P＜0.01）正常對照組（39.46±23.11）及治療組（84.61±29.36）水平，正常對照組與治療組無顯著性差異(P＞0.05)。模型組HYP（3.07±0.47）水平明顯高于（P＜0.01）正常對照組（1.63±0.78）及治療組（2.06±0.83）水平，正常對照組與治療組無顯著性差異(P＞0.0

10、5)。
　　2、Locostatin可以降低Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及α-SMA mRNA的表達量，增加Ⅳ型膠原及RKIP mRNA的表達量。
　　2.1 Locostatin可以降低Ⅰ型及Ⅲ型膠原mRNA的表達量:治療組Ⅰ型膠原mRNA的相對表達量（3.60±0.31）較模型組（9.51±1.37）顯著降低(P＜0.01)。治療組Ⅲ型膠原mRNA的相對表達量（1.25±0.22）較模型組(3.23±0.43)顯著降低（P＜0.0

11、1）。
　　2.2模型組中Ⅳ型膠原mRNA表達量減少，Locostatin可以增加Ⅳ型膠原mRNA表達量:模型組Ⅳ型膠原mRNA的相對表達量（0.71±0.21）較治療組(4.80±1.22)顯著降低(P＜0.01)。
　　2.3模型組TIMP-1、MMP-13、TIMP-2、MMP-2 mRNA的相對表達量（0.84±0.14，0.91±0.02，0.45±0.05，0.73±0.25）較治療組（0.79±0.13，0.6

12、0±0.22，0.49±0.18，0.58±0.16）無明顯差異(P＞0.05)。
　　2.4 Locostatin可以降低α-SMA mRNA表達量:模型組α-SMA mRNA相對表達量(6.73±0.10)較治療組（2.71±0.31）顯著升高（P＜0.01）。
　　2.5 Locostatin可以增加RKIP mRNA的表達量:治療組RKIP mRNA的相對表達量（3.49±0.50）較模型組（1.06±0.16）顯著

13、升高(P＜0.01)。
　　3 Locostatin可以降低Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、α-SMA蛋白表達量，增加Ⅳ型膠原、RKIP蛋白表達量。
　　3.1模型組中Ⅰ型膠原蛋白表達升高，Locostatin可以降低Ⅰ型膠原蛋白表達:治療組（0.68±0.06）較正常對照組（0.22±0.04）Ⅰ型膠原蛋白的表達量顯著增高(P＜0.01)，治療組Ⅰ型膠原蛋白表達量較模型組（1.37±0.13）明顯降低（P＜0.01）。
　　3.

14、2模型組中Ⅲ型膠原蛋白表達升高，Locostatin可以降低Ⅲ型膠原蛋白表達:治療組（0.16±0.02）較正常對照組(0.11±0.02)Ⅲ型膠原蛋白的表達量顯著增高（P＜0.01），治療組Ⅲ型膠原蛋白表達量較模型組（0.26±0.07）明顯降低(P＜0.01)。
　　3.3模型組中Ⅳ型膠原蛋白表達量最低，而Locostatin可以增加Ⅳ型膠原蛋白表達:模型組Ⅳ型膠原蛋白相對表達量（0.21±0.04）較正常對照組(0.38±0

15、.07)及治療組（0.68±0.04）均顯著降低(P＜0.01)，正常對照組蛋白相對表達量較治療組顯著降低(P＜0.01)。
　　3.4模型組中α-SMA蛋白表達增加，Locostatin干預(yù)可以減少HSCs的活化，降低α-SMA蛋白的表達:模型組α-SMA蛋白相對表達量（1.54±0.13）比正常對照組（0.42±0.04）及治療組（0.63±0.06）顯著升高(P＜0.01)，治療組α-SMA蛋白表達量比正常對照組明顯升高(P

16、＜0.05)。
　　3.5 CCl4造模不會影響RKIP的表達，但Locostatin干預(yù)可以反應(yīng)性的引起RKIP表達量升高:治療組RKIP蛋白的相對表達量（0.82±0.12）較模型組（0.46±0.09）均顯著增高(P＜0.01)，正常對照組（0.29±0.05）及模型組RKIP蛋白的相對表達量無明顯差異(P＞0.05)。
　　4、Locostatin通過調(diào)節(jié)MMP-13及TIMP-1的比值，促進Ⅰ型及Ⅲ型膠原降解。

17、r>　　4.1 CCl4造模可以降低TIMP-1蛋白的表達，Locostatin干預(yù)對TIMP-1蛋白含量影響不大:模型組（136.88±39.51）及治療組（140.39±24.70）TIMP-1的表達量比正常對照組（244.29±74.25）顯著降低(P＜0.05)，模型組及治療組TIMP-1的表達無明顯差異（P＞0.05）。
　　4.2模型組中MMP-13蛋白的表達降低，Locostatin干預(yù)對MMP-13蛋白含量影響不大

18、:模型組（23.04±4.05）及治療組（20.44±5.35）MMP-13的表達比正常對照組（31.96±8.28）明顯降低(P＜0.05)，模型組及治療組MMP-13的表達無明顯差異(P＞0.05)。
　　4.3模型組中TIMP-2蛋白的表達降低，Locostatin干預(yù)對TIMP-2蛋白含量影響不大:模型組（8.72±5.17）及治療組（9.42±3.01）TIMP-2的表達量比正常對照組(18.07±7.18)明顯降低(P

19、＜0.05)，模型組及治療組TIMP-2的表達無明顯差異(P＞0.05)。
　　4.4模型組中MMP-2蛋白的表達降低，Locostatin干預(yù)對MMP-2蛋白含量影響不大:模型組（326.42±64.63）及治療組（342.54±66.73）MMP-2的表達量比正常對照組（700.99±245.48）顯著降低(P＜0.01)，模型組及治療組MMP-2的表達無明顯差異(P＞0.05)。
　　4.5 Locostatin可以促

20、進膠原降解:模型組（0.17±0.02）及治療組（0.19±0.01）MMP-13/TIMP-1比值較正常對照組(0.13±0.02)顯著升高（P＜0.01），模型組MMP-13/TIMP-1比值比治療組顯著降低(P＜0.01)。
　　4.6正常對照組（0.40±0.07）、模型組（0.39±0.02）及治療組（0.43±0.03）三組MMP-2/TIMP-2相比，無明顯差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論: Locostati