蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在蛇毒鑒定中的探索研究.pdf

1、毒蛇咬傷常見于熱帶和亞熱帶地區(qū)。在非洲、亞洲、大洋洲和拉丁美洲的農(nóng)村地區(qū)，毒蛇咬傷是特別突出的公共衛(wèi)生問題。最近的一項(xiàng)研究估計(jì)：全球范圍內(nèi)，每年遭受毒蛇咬傷的人數(shù)超過5億，導(dǎo)致25,000-125,000人死亡。在法醫(yī)工作中，懷疑是蛇毒中毒的案件經(jīng)常發(fā)生，確定是否是蛇毒中毒，是哪種蛇毒中毒，是解決該類案件的關(guān)鍵。目前，我國的蛇傷鑒定方法主要是依靠觀察牙痕、癥狀和生化常規(guī)檢查，其中牙痕是關(guān)鍵。但是，在實(shí)際工作中又經(jīng)常會(huì)碰到?jīng)]有明顯牙痕的案

2、件，這時(shí)就得憑經(jīng)驗(yàn)通過癥狀和生化指標(biāo)來判斷是否是蛇毒中毒、是哪種蛇毒中毒，錯(cuò)誤判斷的可能性非常大，因此，我們亟需新的鑒定技術(shù)。
　　本研究選擇了中國境內(nèi)常見的4種蛇毒（中華眼鏡蛇毒、五步蛇毒、金環(huán)蛇毒、銀環(huán)蛇毒），運(yùn)用以液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)為依托的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)開展蛇毒的體內(nèi)外蛋白質(zhì)組學(xué)研究，既探索每種蛇毒的高豐度特征毒素蛋白，也探索蛇毒對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物內(nèi)源蛋白質(zhì)的影響，以期獲得蛇毒中毒的生物標(biāo)志物，為蛇傷案件的鑒定提供新方法。主要研究

3、內(nèi)容分為以下3個(gè)部分。
　　第一部分中國境內(nèi)4種常見蛇毒的體外蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　為了了解不同蛇毒的蛋白質(zhì)豐度特征，我們將五步蛇毒、眼鏡蛇毒、銀環(huán)蛇毒和金環(huán)蛇毒用胰蛋白酶酶解后以基于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，獲得的肽段數(shù)據(jù)用 MaxQuant軟件進(jìn)行無標(biāo)記定量。結(jié)果顯示Metalloproteinases、C-type lectins和antithrombin是五步蛇毒中的高豐度蛋白質(zhì)，它們的豐度分別為25.

4、4％、24.6%和23.6%；cardiotoxins是眼鏡蛇毒的高豐度蛋白，其豐度達(dá)到了77.1%；在銀環(huán)蛇毒中，beta-bungaratoxin和short neurotoxin homolog NTL4的豐度分別為21.1%和46.6%；在金環(huán)蛇毒中，acetylcholinesterase則以39.8%的豐度居于首位。本部分研究結(jié)果表明不同蛇毒在蛋白質(zhì)組成和豐度上有顯著差異，可以成為法庭科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)蛇傷鑒定的基礎(chǔ)和依據(jù)。

5、r>　　第二部分注射蛇毒引起的大鼠血清蛋白變化
　　為了探尋蛇毒導(dǎo)致的血清內(nèi)源蛋白變化，我們從蛋白質(zhì)組學(xué)層面考查了蛇傷時(shí)間和蛇毒劑量對(duì)血清蛋白質(zhì)的影響。我們選擇了SD大鼠，將4種蛇毒通過腿部肌肉注入大鼠體內(nèi)，在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)收集血清，血清經(jīng)預(yù)處理后用液質(zhì)聯(lián)用方法檢測(cè)蛋白質(zhì)變化，并用Peaks Studio進(jìn)行iTRAQ8Plex鑒定和定量，定量信息經(jīng)聚類以尋找隨時(shí)間變化表達(dá)量有逐步上調(diào)及下調(diào)趨勢(shì)的大鼠蛋白。隨后，這些有明顯變化趨勢(shì)的

6、蛋白被進(jìn)行了IPA分析（下游功能效應(yīng)分析、通路分析、調(diào)控趨勢(shì)變化、蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析）。Peaks Studio的定量結(jié)果進(jìn)一步按照實(shí)驗(yàn)組蛋白強(qiáng)度與對(duì)照組蛋白強(qiáng)度的比值<0.7或>1.33進(jìn)行篩選，以獲得在各組大鼠血清中差異明顯的蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示五步蛇毒組大鼠的血清內(nèi)源蛋白變化是本實(shí)驗(yàn)中最多的（83個(gè)蛋白），并且主要集中在Fibrinogen、Coagulation factor、Tropomyosin、Tubulin、Myosin

7、等與血液凝固和細(xì)胞骨架相關(guān)的蛋白上；眼鏡蛇毒高濃度組有47個(gè)蛋白發(fā)生濃度改變，且低濃度組也有28個(gè)蛋白改變了濃度；環(huán)蛇屬的銀環(huán)蛇毒導(dǎo)致的血清內(nèi)源蛋白變化很少，但是在為數(shù)不多的變化了的內(nèi)源蛋白中出現(xiàn)了與神經(jīng)通路相關(guān)的蛋白。這表明不同蛇毒會(huì)導(dǎo)致不同的內(nèi)源蛋白發(fā)生變化，相應(yīng)內(nèi)源蛋白的改變則可以與不同的蛇傷聯(lián)系起來。在濃度變化明顯的內(nèi)源蛋白中，有一些蛋白在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)出持續(xù)上調(diào)或持續(xù)下調(diào)，在對(duì)這些蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)的文獻(xiàn)調(diào)查后，我們選出了Reti

8、nol-binding protein4、L-selectin、Troponin I、Protein Z-dependent protease inhibitor作為眼鏡蛇毒中毒的潛在生物標(biāo)志物；Fibrinogen作為五步蛇毒中毒的潛在生物標(biāo)志物；EH domain-containing protein1作為銀環(huán)蛇毒中毒的潛在生物標(biāo)志物。
　　第三部分注射蛇毒引起的大鼠肌肉蛋白變化
　　為了探尋蛇毒對(duì)肌肉組織內(nèi)源蛋白的影響

9、，我們用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了蛇傷動(dòng)物的肌肉組織。肌肉的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)用Peaks Studio進(jìn)行iTRAQ8Plex鑒定和定量，并對(duì)定量信息進(jìn)行了聚類，尋找上調(diào)和下調(diào)的大鼠蛋白，并對(duì)這些有明顯變化趨勢(shì)的蛋白進(jìn)行了IPA分析。分析的主要類型包括：功能效應(yīng)分析、通路分析和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。Peaks Studio的定量結(jié)果進(jìn)一步按照實(shí)驗(yàn)組蛋白強(qiáng)度與對(duì)照組蛋白強(qiáng)度的比值<0.7或>1.33進(jìn)行篩選，以獲得在各組大鼠組織中差異明顯的蛋白質(zhì)。

10、研究發(fā)現(xiàn)不同蛇毒導(dǎo)致的組織內(nèi)源蛋白變化有明顯不同，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了蛇毒成分之一的MPPA在5組大鼠傷口組織中均明顯上調(diào)，該蛋白或許可以作為蛇毒中毒的外源標(biāo)志物。五步蛇毒組大鼠的HBA/HBB、LEG5、FGA相對(duì)對(duì)照組及其它實(shí)驗(yàn)組有顯著高表達(dá)，可以考慮作為五步蛇毒中毒的內(nèi)源性潛在生物標(biāo)志物。在銀環(huán)蛇毒組，GC和GELS相對(duì)對(duì)照組表達(dá)上調(diào)，而IPKA、ACSL1、DOPD和ACADV則相對(duì)對(duì)照組表達(dá)下調(diào)，這6個(gè)蛋白有望成為銀環(huán)蛇毒中毒的內(nèi)源標(biāo)

11、志物。金環(huán)蛇毒組的FGA和FGB表達(dá)上調(diào)都超過了2倍，其它內(nèi)源蛋白如PLMN、TF、ALB、C9和APOH相對(duì)其它4組實(shí)驗(yàn)也具有顯著高表達(dá)，有望作為金環(huán)蛇咬傷的蛋白質(zhì)標(biāo)志物。在眼鏡蛇毒組大鼠組織中，GELS、HSP71、ATN2和SYNPO均有顯著的差異表達(dá)，可以作為潛在的標(biāo)志因子用眼鏡蛇咬傷的診斷。
　　小結(jié)
　　本課題運(yùn)用基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)首次系統(tǒng)研究了中國境內(nèi)常見的4種蛇毒（五步蛇毒、中華眼鏡蛇毒、金環(huán)蛇毒、銀環(huán)