蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)及其在低劑量輻射生物效應(yīng)中的應(yīng)用

1、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)及其在低劑量輻射生物效應(yīng)中的應(yīng)用,主要內(nèi)容,20世紀(jì)三大科學(xué)計(jì)劃：曼哈頓原子彈研制計(jì)劃、阿波羅登月計(jì)劃、人類基因組計(jì)劃(HGP)HGP是由美國(guó)學(xué)者1985年在美國(guó)能源部的一次會(huì)議上討論，并由諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Renato Dulbecco 于1986年在Science 雜志發(fā)表的一篇文章中提出的.其目的是闡明人類基因組30億個(gè)堿基對(duì)的序列，發(fā)現(xiàn)所有人類基因并闡明其在染色體上的位置，從而在整體上破譯人類遺傳信息。該計(jì)劃啟動(dòng)

2、于1990年，原定15年完成，由于技術(shù)的成熟與基因組測(cè)序的規(guī)?；\(yùn)作，以及來(lái)自商業(yè)競(jìng)爭(zhēng)方面的壓力，2000年6月26日基因組序列草圖測(cè)序完成。,人類基因組以及多種模式生物、重要生物基因組全序列的完成，標(biāo)志著生命科學(xué)研究進(jìn)入所謂的“后基因組時(shí)代 (Postgenome era)”, 即產(chǎn)生了功能基因組學(xué)（Functional Genomics）,結(jié)構(gòu)基因組學(xué)：以全基因組測(cè)序?yàn)槟繕?biāo)；“靜態(tài)的”功能基因組學(xué)：以基因功能鑒定為目標(biāo)，又稱

3、后基因組研究；“動(dòng)態(tài)的”,轉(zhuǎn)錄組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)代謝組學(xué)表型組學(xué)相互作用組 ……,功能基因組學(xué),,蛋白質(zhì)組(proteome) PROTEOME = PROTEin +genOME 最早是由澳大利亞學(xué)者Wilkins和Williams等人于1994年提出，并首次公開(kāi)發(fā)表在1995年7月的Electrophoresis雜志上，指的是由一個(gè)細(xì)胞、一個(gè)組織或是一種生物的基因組所表達(dá)的全部相應(yīng)的蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)

4、組學(xué)（Proteomics） 指應(yīng)用各種技術(shù)手段來(lái)研究蛋白質(zhì)組的一門新興科學(xué)，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞或組織內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律。,蛋白質(zhì)組與基因組相對(duì)應(yīng)，也是一個(gè)整體的概念，是基因組表達(dá)的全部蛋白。但兩者又有根本的不同之處 基因組是靜態(tài)的，一個(gè)有機(jī)體從它的發(fā)生、發(fā)展到衰老、死亡，不同細(xì)胞、組織和器官的基因組是基本穩(wěn)定不

5、變。蛋白質(zhì)組作為基因組表達(dá)的產(chǎn)物隨時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境等條件變化，是一個(gè)動(dòng)態(tài)的概念。 在人類基因組計(jì)劃中大約有30,000個(gè)基因被鑒定出來(lái)。一個(gè)基因=平均4個(gè)左右的剪接變異體，約120,000或更多的獨(dú)立蛋白。翻譯后修飾和蛋白相互作用，蛋白質(zhì)組比基因組復(fù)雜10倍以上。,蛋白質(zhì)組學(xué)與基因組學(xué)的聯(lián)系與區(qū)別,Proteomics,生理病理過(guò)程的復(fù)雜性,,研究技術(shù)的高通量性,人類蛋白質(zhì)組正式啟動(dòng),2001年成立國(guó)際人類蛋白質(zhì)組組織（HUPO），2

6、003.12.15啟動(dòng)兩個(gè)首批行動(dòng)計(jì)劃， 2003成立了中國(guó)人類蛋白質(zhì)組組織（CHHUPO）人類肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃（HLPP）由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院副院長(zhǎng)賀福初院士領(lǐng)導(dǎo)，16國(guó)80多個(gè)實(shí)驗(yàn)室參加。中國(guó)第一次領(lǐng)導(dǎo)重大國(guó)際協(xié)作計(jì)劃。人類血漿蛋白質(zhì)組計(jì)劃（HPPP）由美國(guó)科學(xué)家牽頭，13國(guó)47個(gè)實(shí)驗(yàn)室參加。,蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容,在蛋白質(zhì)水平上定量、動(dòng)態(tài)、整體地研究生物體，它旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及功能模式。 1）組成（表

7、達(dá)）蛋白質(zhì)組學(xué)—了解某種特定的細(xì)胞、組織或器官制造的蛋白質(zhì)種類；蛋白質(zhì)表達(dá)譜（組織、器官、細(xì)胞、亞細(xì)胞分布等） 2）比較蛋白質(zhì)組學(xué)—尋找正常組織與異常組織蛋白表達(dá)差異 3）結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)—描繪蛋白質(zhì)的精確三維結(jié)構(gòu)，揭示其結(jié)構(gòu)上的關(guān)鍵部位，如與藥物結(jié)合并且決定其活性的部位。 4）功能蛋白質(zhì)組學(xué)—蛋白質(zhì)的功能和相互作用；明確各種蛋白質(zhì)分子是如何形成類似于電路的網(wǎng)絡(luò)； 5）蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)平臺(tái)與生物

8、信息學(xué)—分離、鑒定技術(shù)，分析軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)。,蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù),蛋白質(zhì)分離技術(shù)基于凝膠系統(tǒng)的分離技術(shù)——雙向凝膠電泳基于非凝膠系統(tǒng)的分離技術(shù)——HPLC；毛細(xì)管電泳 蛋白質(zhì)鑒定技術(shù) Edman 測(cè)序 質(zhì)譜技術(shù)；生物信息學(xué)技術(shù) 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)；相互作用研究技術(shù) 酵母雙雜交技術(shù) 免疫共沉淀等,蛋白質(zhì)分離技術(shù)雙向凝膠電泳基本原理：第一向?yàn)榈入娋劢?Isoelectro focusing, IEF)，根據(jù)蛋白的等電點(diǎn)不

9、同進(jìn)行分離；第二向?yàn)镾DS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，按亞基分子量大小進(jìn)行分離優(yōu)點(diǎn)：較高的分辨率，可同時(shí)分離上萬(wàn)種蛋白質(zhì)缺點(diǎn)：不適用于檢測(cè)低豐度蛋白、疏水性及強(qiáng)酸強(qiáng)堿性蛋白；尚不能完全自動(dòng)化，消耗時(shí)間長(zhǎng)。,Spot Excision,雙向電泳流程,凝膠的圖像處理分析和膠內(nèi)酶切,凝膠圖像的掃描：圖像加工：斑點(diǎn)檢測(cè)和定量：凝膠配比：數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)呈遞和解釋：2-DE數(shù)據(jù)庫(kù)的建立：,圖像掃描和分析——Image

10、Scanner II,全自動(dòng)斑點(diǎn)切取系統(tǒng)（Ettan Spot Picker）,,蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)Edman 降解優(yōu)點(diǎn)：測(cè)定肽序列，非常準(zhǔn)確缺點(diǎn)：成本高、測(cè)序速度較慢、靈敏度低，不適合鑒定數(shù)以百計(jì)的蛋白質(zhì) 質(zhì)譜法原理：通過(guò)電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為氣相離子，然后利用質(zhì)譜分析儀的電場(chǎng)、磁場(chǎng)將具有特定質(zhì)量與電荷比值(M/Z 值)的蛋白質(zhì)離子分離開(kāi)來(lái)，經(jīng)過(guò)離子檢測(cè)器收集分離的離子，確定離子的M/Z 值，分析鑒定未知蛋白質(zhì)。,質(zhì)譜分析的特

11、點(diǎn),,,,主要可以分為三種方法,質(zhì)譜分析方法,串聯(lián)質(zhì)譜序列分析,串聯(lián)質(zhì)譜（Tandem-MS）,第一級(jí)質(zhì)譜得到肽的分子離子,選取目標(biāo)肽的離子作為母離子，與惰性氣體碰撞，使肽鏈中的肽鍵斷裂，形成一系列離子，即N端碎片離子系列（B系列）和C端碎片離子系列（Y系列），將這些碎片離子系列綜合分析，可得出肽段的氨基酸序列?！皃rotein ladder sequencing”的方法，通過(guò)對(duì)Edman降解法的修改，產(chǎn)生一系列截去N端殘基的肽段，用

12、MALDI-MS測(cè)得這些肽段的質(zhì)量，從而推測(cè)N端序列。,,生物信息學(xué)技術(shù),通過(guò)質(zhì)譜所獲得的鑒定結(jié)果通常都是高通量且比較復(fù)雜的，分析這些數(shù)據(jù)必須要通過(guò)自動(dòng)化的方式對(duì)其進(jìn)行識(shí)別、比較和分析。 生物信息學(xué)（Bioinformatics）就是通過(guò)計(jì)算機(jī)以及信息理論對(duì)獲得的蛋白質(zhì)、核酸序列等大量的生物信息進(jìn)行采集、處理、存儲(chǔ)、分析及解釋，并結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)、計(jì)算機(jī)和生物醫(yī)學(xué)等來(lái)獲得其具有的各種生物學(xué)功能的一門新興的邊緣學(xué)科。 借助生物信息

13、學(xué)分析能夠進(jìn)一步了解和分析被測(cè)蛋白的種類、屬性、結(jié)構(gòu)、生物功能及其同源蛋白。,蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)SWISS-PROT/TrEMBL；http://www.expasy.ch）基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)Genbank，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ EMBL， http://www.ebi.ac.uk/）蛋白模式數(shù)據(jù)庫(kù)Prosite；http://www.expasy.ch/sprot/prosite.html）蛋

14、白質(zhì)二維凝膠電泳數(shù)據(jù)庫(kù)、蛋白三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)PDB，http://www.pdb.bnl.gov/；FSSP，http://www.embl-ebi.ac.uk）蛋白翻譯后修飾數(shù)據(jù)庫(kù)OGLYCBASE，http://www.cbs.dtu.dk/databases/ OGLYCBASE）,蛋白質(zhì)組學(xué)研究相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù),蛋白相互作用研究技術(shù)研究蛋白質(zhì)間的相互作用的常用方法：酵母雙雜交系統(tǒng)親和層析免疫沉淀蛋白質(zhì)交聯(lián) 酵

15、母雙雜交系統(tǒng)是當(dāng)前發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛的主要方法。,轉(zhuǎn)錄激活因子轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的(modular),即這些因子往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain,簡(jiǎn)稱為DB)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain,簡(jiǎn)稱為AD),它們是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。單獨(dú)的DB雖然能和啟動(dòng)子結(jié)合,但是不能激活轉(zhuǎn)錄。,酵母雙雜交系統(tǒng)的建立與發(fā)展,報(bào)告基因,DB與

16、AD分離，不轉(zhuǎn)錄,DB與AD結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄,雙雜交的原理兩個(gè)等測(cè)蛋白質(zhì)1和2, 前者與酵母菌轉(zhuǎn)錄激活因子Gal4的DB結(jié)合, 另一個(gè)與Gal4的AD結(jié)合。,由DB和AD形成的融合蛋白現(xiàn)在一般分別稱之為“誘餌”(bait)和“獵物”(fish)。,HIS基因表達(dá),,早期抑制糖分解及丙酮酸脫氫酶晚期影響脂代謝，促進(jìn)炎癥反應(yīng),小鼠出生第十天七個(gè)月后處死主要涉及通路：代謝、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞骨架通路,蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)室所需的條件,Thank