兒童急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞對(duì)組蛋白去乙酰化酶抑制劑Panobinostat反應(yīng)性研究.pdf

1、經(jīng)過(guò)超過(guò)半個(gè)世紀(jì)的努力，兒童急性淋巴細(xì)胞白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia,ALL）的治療效果得到了長(zhǎng)足的進(jìn)步，兒童ALL的總體治愈率，由二十世紀(jì)60年底的低于10％總體生存率，到現(xiàn)在基本達(dá)到80%左右。在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家，個(gè)體化精準(zhǔn)和系統(tǒng)性治療(如藥物動(dòng)力學(xué)和藥物基因?qū)W)使得兒童ALL治愈率已超過(guò)90%。隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的顯著進(jìn)步，現(xiàn)階段兒童ALL治療的焦點(diǎn)正從強(qiáng)調(diào)整體治愈率轉(zhuǎn)向強(qiáng)調(diào)精準(zhǔn)化治療以及個(gè)體化治療，

2、提高白血病患者的生存質(zhì)量。
　　傳統(tǒng)化療藥物相關(guān)引起的毒副作用或相關(guān)性死亡、繼發(fā)性腫瘤及復(fù)發(fā)是目前白血病治療過(guò)程中亟需要解決的臨床問(wèn)題。目前臨床一線抗ALL白血病細(xì)胞藥物可以大致分為三類(lèi)：
　　1、直接損害DNA類(lèi)藥物（蒽環(huán)霉素和烷基化劑）；
　　2、抗代謝物（如甲氨蝶呤、巰嘌呤類(lèi)藥物、阿糖胞苷）；
　　3、轉(zhuǎn)錄后作用藥物（長(zhǎng)春新堿、糖皮質(zhì)激素和天冬酰胺酶）。由于常規(guī)化療藥物的作用非特異性，因此他們都存在著潛在的

3、毒副反應(yīng)，這些毒副作用都能?chē)?yán)重影響患兒預(yù)后的遠(yuǎn)期生存質(zhì)量，甚至危及生命。包括如：胰腺炎（天冬酰胺酶）、骨壞死（糖皮質(zhì)激素）、骨髓抑制（蒽環(huán)霉素、烷基化劑）和繼發(fā)性腫瘤（足葉已甙）等。
　　越來(lái)越多的研究成果提示：惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展除了與基因組異常密切相關(guān)，異常的表觀遺傳修飾也同樣扮演者重要角色，并可能成為潛在治療靶點(diǎn)。
　　表觀遺傳修飾，是指基因組DNA序列不發(fā)生改變的情況下，由于細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，引起基因表達(dá)水平與

4、功能的改變，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA等。眾所周知，基因的組蛋白修飾特征（如乙?；⒓谆⒘姿峄?，泛素化）與其生物學(xué)功能密切相關(guān)，其修飾特征的變化也將引起組蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生相應(yīng)變化，導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)改變，最終引起生物學(xué)功能異常。
　　組蛋白乙?；瘜儆谀壳把芯勘容^深入的表觀遺傳修飾，穩(wěn)定的乙酰化水平主要取決于組蛋白乙?；福℉istone acetylase，HAT）和組蛋白去乙酰化酶（Histone Deacety

5、lase，HDAC）之間的相互協(xié)調(diào)作用。HAT，將乙酰輔酶A乙?；糠洲D(zhuǎn)移到核心組蛋白氨基末端上特定賴氨酸殘基的ε-氨基基團(tuán)，有利于DNA構(gòu)象的展開(kāi)，使染色質(zhì)處于松弛的狀態(tài)，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄基因區(qū)域的活性。HAT異常與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，由于染色體異位、倒置等造成HAT活性的異常而引起基因表達(dá)的異常，在急性白血病發(fā)生和發(fā)展中十分重要。HDAC通過(guò)對(duì)組蛋白去乙?；{(diào)節(jié)，移去組蛋白賴氨酸殘基上的乙?；鶊F(tuán)，使DNA結(jié)構(gòu)更加緊密，抑制轉(zhuǎn)錄水平，從而

6、導(dǎo)致基因的表達(dá)下降甚至不表達(dá)。此外，HDAC能夠被某些腫瘤融合基因、腫瘤蛋白復(fù)合物的特定基因啟動(dòng)子區(qū)域異常招募，從而抑制細(xì)胞正常分化，促使白血病的發(fā)生。HAT/HDAC的失衡也對(duì)藥物反應(yīng)性產(chǎn)生影響。
　　越來(lái)越多研究提示：HDAC抑制劑能特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，其中個(gè)別抑制劑已經(jīng)獲得FDA批準(zhǔn)在臨床上應(yīng)用。如：Vorinostat、Belinostat、Romidepsin和Chidamide等藥已經(jīng)正式屬于淋巴瘤臨床化療用藥，并且在

7、其他血液腫瘤，如AML、CML等白血病中，也表現(xiàn)出明顯抗腫瘤活性。Panobinostat（pan-HDAC inhibitor）作為新型廣譜的HDAC抑制劑，對(duì)I類(lèi)HDAC、II類(lèi)HDAC以及IV類(lèi)HDAC均表現(xiàn)抑制作用。在實(shí)體瘤和血液腫瘤的的研究中表明Panobinostat同樣具有明顯的抗腫瘤活性，主要是通過(guò)增加組蛋白或/和非組蛋白乙?；胶虷SP90等水平。Panobinostat不僅單獨(dú)對(duì)白血病細(xì)胞造成殺傷作用，通過(guò)其他化療

8、藥物聯(lián)合使用更能逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞的耐藥，增強(qiáng)白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。更重要的是，Panobinostat與其他類(lèi)型的HDAC抑制劑相比較，達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的藥物濃度更低，高濃度的Panobinostat對(duì)正常的造血細(xì)胞幾乎沒(méi)有影響。這些資料提示Panobinostat在治療急性淋巴細(xì)胞白血病中可能具有理想的臨床轉(zhuǎn)化前景。
　　因此，本研究對(duì)Panobinostat在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的作用進(jìn)行探討。本課題首先利用ALL

9、細(xì)胞基因表達(dá)譜、全外顯子測(cè)序等高通量數(shù)據(jù)對(duì)ALL組蛋白乙?；揎椞卣飨嚓P(guān)基因進(jìn)行特征分析；與此同時(shí)，我們利用初發(fā)兒童急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞作為研究對(duì)象，對(duì)Panobinostat的半數(shù)殺傷濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并關(guān)聯(lián)Panobinostat反應(yīng)性與兒童ALL的臨床特征。
　　研究目的：
　　1.明確ALL組蛋白乙酰化修飾特征；
　　2.初步探討Panobinostat對(duì)初診兒童ALL的作用及其特點(diǎn)；
　　3.關(guān)聯(lián)Panob

10、inostat反應(yīng)性與兒童ALL臨床特征；
　　研究方法：
　　1.收集相關(guān)ALL表達(dá)譜數(shù)據(jù)，外顯子測(cè)序數(shù)據(jù)等高通量數(shù)據(jù)進(jìn)行ALL組蛋白乙酰化修飾相關(guān)基因特征分析描述；
　　2.利用MTT實(shí)驗(yàn)研究Panobinostat對(duì)初診ALL細(xì)胞的抑制作用；
　　3.收集ALL初診時(shí)相關(guān)臨床資料，進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析;
　　研究結(jié)果：
　　1.不同基因型ALL患者中存在HDAC的表達(dá)，不同HDAC亞型之間的表達(dá)水平具

11、有差異性；
　　2.不同的初診ALL細(xì)胞對(duì)Panobinostat的反應(yīng)性不同，大部分（83.3%）患者Panobinostat的IC50低于1000nM，少部分（16.7%）患者Panobinostat的IC50高于10uM以上；
　　3.根據(jù)ALL患者初診臨床特征分析，患者的年齡、細(xì)胞與基因型不具有相關(guān)性與Panobinostat的反應(yīng)性不存在相關(guān)性，Blast%與Panobinostat的反應(yīng)性存在相關(guān)性。
　　

12、研究結(jié)論：
　　1.原代ALL細(xì)胞中存在HDAC表達(dá)情況，不同類(lèi)型ALL細(xì)胞中HDAC表達(dá)也具有差異性；
　　2.ALL患者中HDAC2/4/7/9高表達(dá)，正常骨髓中HDAC3/8高表達(dá)，此外HDAC基因突變頻率低；
　　3.Panobinostat對(duì)原代初發(fā)ALL細(xì)胞具有抑制作用，并且原代初發(fā)ALL細(xì)胞對(duì)Panobinostat的反應(yīng)性具有濃度差異、個(gè)體差異性；
　　4.ALL患者幼稚細(xì)胞比例Blast%與Pa