牙鲆CD3多克隆抗體制備及其在T細胞鑒定中的應(yīng)用.pdf

1、T細胞在魚類細胞免疫及抗感染過程中起著重要作用,CD3分子是僅存在于T淋巴細胞的一種膜表面抗原,與T細胞抗原受體(TCR)相連,參與T淋巴細胞的信號轉(zhuǎn)導,可用于標記T淋巴細胞、胸腺細胞等。根據(jù)抗體可與抗原特異性結(jié)合的特性,通過制備CD3分子抗體,則可用其對魚體組織中T淋巴細胞進行研究。
　　論文根據(jù)已公布的牙鲆CD3ε基因序列重組表達了牙鲆CD3,并制備了可特異性識別T細胞的抗CD3多克隆抗體(多抗),利用該多抗研究了牙鲆T細胞的

2、組織分布及注射滅活愛德華氏菌后的數(shù)量變化。本文為深入研究T細胞在魚類免疫系統(tǒng)中的作用,理解魚類細胞免疫應(yīng)答機制奠定了基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下:
　　本文根據(jù)牙鲆CD3ε基因序列設(shè)計特異性引物,通過PCR擴增、產(chǎn)物純化獲得了CD3ε基因;將CD3基因片段與表達載體pET-30a質(zhì)粒連接,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中進行誘導表達,SDS-PAGE電泳分析表明,表達蛋白的相對分子質(zhì)量約為27kDa(包含7kDa的標簽蛋白),質(zhì)譜鑒

3、定確認為牙鲆CD3蛋白。親和層析法純化重組表達蛋白,用其免疫Balb/c小鼠制備鼠抗CD3多克隆抗體。
　　利用該多抗與牙鲆白細胞進行免疫共沉淀,發(fā)現(xiàn)它可以特異性識別一個20kDa的蛋白,質(zhì)譜分析鑒定為牙鲆CD3。利用抗CD3多抗和抗IgM單克隆抗體對牙鲆白細胞進行間接免疫熒光共染色,發(fā)現(xiàn)了CD3+/IgM-、CD3-/IgM+和CD3-/IgM-三種白細胞,且CD3+白細胞與IgM+白細胞無交叉,表明抗牙鲆CD3多抗能夠特異性識

4、別T淋巴細胞,與抗IgM單克隆抗體標記的B淋巴細胞無交叉反應(yīng)。
　　利用抗CD3多抗對牙鲆外周血白細胞、鰓、表皮、胃、腸、脾、頭腎、體腎、肝臟、心臟及性腺進行免疫組織化學染色,結(jié)果顯示在牙鲆的外周血白細胞、鰓上皮、表皮、胃黏膜固有層及胃腺、腸上皮、脾表面漿膜及白髓中、頭腎表面結(jié)締組織被膜及頭腎組織內(nèi)、體腎的腎小管上皮、肝臟及心臟中觀察到紅色陽性信號,而在性腺及陰性對照中未觀察到陽性信號。利用抗CD3多抗為探針,流式細胞術(shù)測定注射滅