脊髓Rac1-PAK信號通路在蜜蜂毒誘導炎性痛發(fā)生和維持中的作用機制.pdf

1、疼痛（Pain）是具有生物學意義的警戒信號，對機體具有自身保護作用。然而，急性痛長期遷延不愈時就會誘發(fā)慢性痛，不僅能造成感覺神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，同時也會導致焦慮、抑郁和認知障礙等精神共病，嚴重影響人們的工作、學習和生活。既往50年的研究在傷害性信號從外周到脊髓的神經(jīng)傳導，以及外周敏化和脊髓中樞敏化機制等方面上取得較大進展。但是，由急性痛向慢性痛的演變過程，及其神經(jīng)調(diào)控機制至今仍舊不清。這為臨床有效診治慢性痛設(shè)置了障礙。目前，探索疼痛發(fā)生、

2、發(fā)展和慢性化機制的研究既是國際前沿神經(jīng)科學研究的熱點，也是醫(yī)學難題之一。
　　外周組織損傷和持續(xù)性炎癥對機體是一種非常強烈而長期的有害刺激。組織損傷后，組織內(nèi)的ATP、H+、K+等炎癥介質(zhì)釋放，從而引起P2X3、TRPV1、TRPV2等通道激活，促使脊髓傷害感受性神經(jīng)元保持高興奮狀態(tài)，并伴隨交感神經(jīng)活化。同時，外周組織損傷和炎癥導致傷害性感受器閾值降低，引起外周敏化。當持續(xù)性的傷害性刺激信號傳導至脊髓背角后，能夠引起傷害性感受神經(jīng)

3、元的激活和敏化即出現(xiàn)所謂的神經(jīng)可塑性變化，如后放電、wind up現(xiàn)象、LTP等中樞敏化現(xiàn)象。脊髓膠質(zhì)細胞的活化、抑制性神經(jīng)元活性降低以及源自脊髓上位腦結(jié)構(gòu)，包括丘腦、皮層、扣帶回、島葉、腦干等的下行痛抑制系統(tǒng)作用的削弱和下行易化系統(tǒng)作用的增強都參與和誘導傷害性反應(yīng)在脊髓背角的表達和敏化，最終導致脊髓前角運動神經(jīng)元興奮性增強，進而易化傷害性反射，形成持續(xù)性自發(fā)痛、痛敏、異常痛敏以及鏡像痛（或痛敏）。
　　經(jīng)過10余年的持續(xù)性研究，

4、我們實驗室證實蜜蜂毒（bee venom,BV）痛模型能夠很好地模擬臨床炎性痛的病理性狀態(tài)特征。向大鼠足底注射蜜蜂毒溶液，不僅可以即刻引起大鼠局部注射區(qū)組織出現(xiàn)長時程的紅腫、滲出等炎性痛表現(xiàn)，而且還可以誘發(fā)出單相、時程持續(xù)達72～96小時的自發(fā)性縮足反應(yīng)行為以及抬足、舔足等特別關(guān)愛受傷足部的行為活動。此外，BV注射后2小時，注射部位可出現(xiàn)原發(fā)性熱痛敏和原發(fā)性機械痛敏，而注射部位遠端出現(xiàn)繼發(fā)性熱痛敏，注射對側(cè)足出現(xiàn)鏡像熱痛敏等。蜜蜂毒模型

5、與以往的福爾馬林、角叉菜膠、酵母多糖等疼痛模型不同，它不僅無種屬差異性，還具有較多的疼痛表型。因此，蜜蜂毒模型是研究病理性痛涉及外周和中樞敏化機制的一個理想的疼痛模型。本課題工作主要基于兩方面目的，一方面探索何種脊髓或者外周信號分子參與蜜蜂毒引起的傷害性反應(yīng)和相應(yīng)痛覺敏化現(xiàn)象的發(fā)生和維持過程；另一方面，以臨床治療為目的，通過蜜蜂毒模型，為臨床病理性痛的防治提供新的藥物治療靶點，從而有效緩解患者的持續(xù)性或慢性痛。
　　Rac1，又稱

6、Ras的C3肉毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate1,Rac1）蛋白是一種Rho家族成員小G蛋白。大量研究表明，Rac1參與對細胞增殖、分化、凋亡的調(diào)節(jié)，還與神經(jīng)元的發(fā)育、存活和神經(jīng)退行性病變密切相關(guān)。有研究指出，Rac1不僅與神經(jīng)元突觸的可塑性變化相關(guān)，而且參與調(diào)節(jié)神經(jīng)病理性痛狀態(tài)下的脊髓神經(jīng)元樹突棘的形態(tài)以及突觸的興奮性和信號傳遞過程。Tan等在多種神經(jīng)病理性痛模型中發(fā)現(xiàn)，外周

7、神經(jīng)損傷后10天、脊髓損傷和燙傷后28天，脊髓樹突棘的數(shù)量、棘頭的大小和長度都發(fā)生改變，且背角WDR（wide dynamic range）神經(jīng)元超興奮，出現(xiàn)熱痛敏和機械痛敏現(xiàn)象；鞘內(nèi)連續(xù)3天給予Rac1特異性抑制劑NSC23766可翻轉(zhuǎn)樹突棘的異常改變，并降低脊髓背角WDR神經(jīng)元的興奮性，從而有效緩解神經(jīng)病理性痛相關(guān)行為。然而迄今為止，在炎性痛條件下涉及脊髓Rac1信號通路的作用并未見報道?；诖耍菊n題通過蜜蜂毒模型研究Rac1-P

8、AK信號通路是否參與外周炎性痛的發(fā)生和發(fā)展。采用蜜蜂毒模型和鞘內(nèi)給予Rac1抑制劑的方式，利用免疫熒光組織化學技術(shù)觀察Rac1在大鼠脊髓背角中的表達和細胞定位分布；應(yīng)用western blotting法觀察Rac1及其下游信號分子蛋白的表達變化；利用行為藥理學的方法評估Rac1抑制劑對蜜蜂毒所致自發(fā)痛、熱痛敏和機械痛敏的抑制作用。
　　實驗結(jié)果如下：
　　1.Rac1在大鼠脊髓背角中的表達和細胞定位分布
　　免疫熒光組

9、織化學技術(shù)顯示Rac1在正常大鼠脊髓背角的淺層（I-II）和深層（III-VI）均有廣泛分布，且Rac1與NeuN存在共標現(xiàn)象，而與GFAP和Iba1則極少共標。以上結(jié)果提示相對于星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞，Rac1主要集中表達于神經(jīng)元胞體中。在大鼠一側(cè)足底接受生理鹽水或BV注射后，免疫熒光雙標記法發(fā)現(xiàn)Rac1仍然主要分布于神經(jīng)元的胞漿中。盡管BV可以引起單位面積下大鼠脊髓淺層（I-II）和深層（III-VI）的GFAP和Iba1的數(shù)量增

10、多，但是與Rac1共標的陽性數(shù)并沒有明顯增多，仍與GFAP和Iba1有極少的共標。
　　2.脊髓Rac1信號通路在大鼠BV引起的炎性痛狀態(tài)下的變化
　　通過Western blotting法檢測大鼠脊髓組織中目的蛋白，實驗發(fā)現(xiàn)Rac1及其下游信號分子PAK磷酸化水平在大鼠足底注射蜜蜂毒2h后明顯增高，而經(jīng)過致炎處理后脊髓組織中的Rac1和PAK總蛋白的相對表達量無明顯變化。提示，在外周持續(xù)性痛狀態(tài)下Rac1信號通路被激活。脊

11、髓鞘內(nèi)給予NSC23766后, Rac1及其下游信號分子PAK的磷酸化水平被有效翻轉(zhuǎn)。此外，通過Rac1激活試劑盒檢測Rac1活性，進一步發(fā)現(xiàn)一側(cè)足底注射蜜蜂毒可引起脊髓雙側(cè)Rac1的活性水平顯著增加，且Rac1的高活性表達可被鞘內(nèi)注射NSC23766完全翻轉(zhuǎn)。既往研究證明絲裂原激活蛋白激酶是GTP-Rac1-PAK的下游分子靶點，且課題組前期實驗已證實炎性痛刺激可引起MAPK的激活，表現(xiàn)為ERK1/2和p38 MAPK磷酸化水平增加。

12、因此，本實驗中我們深入觀察炎性痛狀態(tài)下Rac1信號通路是否參與MAPK信號通路的調(diào)控。實驗結(jié)果表明Rac1抑制劑NSC23766可顯著降低BV引起的p-ERK和p-p38增加，而ERK和p38總蛋白沒有明顯變化。
　　3.鞘內(nèi)給藥阻斷Rac1信號通路對BV引起的炎性痛的作用
　　在行為藥理學水平上，BV注射前給予NSC23766能夠劑量依賴性地完全抑制蜜蜂毒誘致的持續(xù)性自發(fā)痛反應(yīng)和原發(fā)性熱痛敏、鏡像熱痛敏，以及部分抑制原發(fā)性

13、機械痛敏，但不抑制對側(cè)機械痛敏；BV注射后2h給予NSC23766（后處理）能夠完全抑制蜜蜂毒皮下注射所誘致的原發(fā)性熱痛敏、鏡像熱痛敏，部分抑制原發(fā)性機械痛敏。
　　4.鞘內(nèi)注射NSC23766對大鼠運動功能的影響
　　利用Rota-Rod裝置我們檢測了NSC23766對正常大鼠運動能力的影響。我們發(fā)現(xiàn)，在前三次實驗中，正常大鼠在儀器上的運動時間呈線性增多，而后五次大鼠在儀器上運動的時間趨于穩(wěn)定。與對照組相比，Rac1對正常

14、SD大鼠的運動協(xié)調(diào)能力沒有影響。
　　結(jié)論:
　　1、細胞水平上，Rac1廣泛分布在脊髓背角淺層（I-II）和深層（III-VI），并與NeuN存在共標，表明Rac1主要表達于神經(jīng)元胞體中。然而Rac1與GFAP和Iba1有極少的共標。說明Rac1主要通過神經(jīng)元發(fā)揮作用。
　　2、外周炎性痛條件下，脊髓背角GTP-Rac1-PAK-ERK/p38 MAPK信號通路被激活，而特異性抑制劑可阻斷Rac1的活性及其下游MAP