NMDA受體抑制劑MK-801抑制大鼠蜜蜂毒炎性痛所致脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞的激活.pdf

1、目的：脊髓是軀體感覺(jué)信息傳入和整合的初級(jí)中樞。近年研究表明，脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞在病理性疼痛的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮重要的作用。研究結(jié)果顯示，多種傷害性刺激都可以使脊髓后角的小膠質(zhì)細(xì)胞激活，使之釋放白介素-1β、腫瘤壞死因子-α等多種細(xì)胞因子，對(duì)傳導(dǎo)病理性疼痛和產(chǎn)生痛覺(jué)過(guò)敏起到促進(jìn)作用。給予P2X4受體阻斷劑TNP-ATP(2'，3'-O-(2，4，6-trini-trophenyl)ATP)、米諾環(huán)素等抑制小膠質(zhì)細(xì)胞功能的藥物，可明顯抑制病理

2、性疼痛和痛過(guò)敏的產(chǎn)生。這些研究成果表明在病理性疼痛和痛過(guò)敏的產(chǎn)生和維持中，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的活化發(fā)揮了重要作用。但脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞被傷害性傳入信息激活的機(jī)制尚不完全清楚。
　　 N－甲基－D－天門冬氨酸(N－methyl－D-aspartate，NMDA)是脊髓后角中重要的神經(jīng)遞質(zhì)，其受體在脊髓后角，包括小膠質(zhì)細(xì)胞上廣泛分布。NMDA及其受體系統(tǒng)在向中樞傳遞外周傷害性信息，誘導(dǎo)痛覺(jué)中樞敏感化方面發(fā)揮重要作用。蜜蜂毒(beevenom

3、，BV)疼痛模型是研究炎性病理性痛的良好模型。此模型是將蜜蜂毒溶液注入大鼠足底皮下中心部位，導(dǎo)致足底組織發(fā)炎紅腫，并引起單相自發(fā)痛反應(yīng)，在注射部位還可以產(chǎn)生原發(fā)性的痛過(guò)敏，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)數(shù)天。我室既往應(yīng)用免疫印跡分析(westernblotanalysis)技術(shù)，初步觀察了蜜蜂毒炎性疼痛模型中脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞的激活、以及NMDA受體在其中所發(fā)揮的作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)則應(yīng)用免疫組化技術(shù)，進(jìn)一步研究蜜蜂毒炎性痛引起的脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)

4、胞的激活情況、以及NMDA受體在此過(guò)程中的作用，為闡明病理性痛過(guò)程中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活機(jī)制提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 1、蜜蜂毒炎性痛大鼠脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞激活的動(dòng)態(tài)過(guò)程
　　 方法：雄性Sprague-Dawley大鼠30只，體重230～270g，隨機(jī)分為6組：sham1h組、sham1d組、蜜蜂毒1h組、蜜蜂毒1d組、蜜蜂毒3d組和蜜蜂毒7d組(每組n=5)。分別將50μl生理鹽水或50μl蜜蜂毒溶液(4g·L-1)

5、注入sham組和蜜蜂毒組大鼠右后足底皮下。Sham1h組和蜜蜂毒1h組動(dòng)物在測(cè)定足底注射后60min內(nèi)的自發(fā)痛反應(yīng)后取材，其它各組于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定注射部位的熱痛敏和機(jī)械痛敏后取材。取材部位為腰5(L5)脊髓節(jié)段。將L5脊髓節(jié)段經(jīng)多聚甲醛固定后，常規(guī)冰凍切片，應(yīng)用免疫組化技術(shù)，觀察脊髓后角OX-42蛋白的表達(dá)情況，評(píng)價(jià)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)。
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示。用社會(huì)科學(xué)統(tǒng)計(jì)程序(StatisticalP

6、rogramforSocialSciences13.0)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-WayANOVA)，比較組間差異。有顯著差異者用最小顯著差法進(jìn)行兩兩比較，判斷差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。
　　 結(jié)果：所有蜜蜂毒組大鼠在注射蜜蜂毒后，均產(chǎn)生注射側(cè)單相性的自發(fā)痛反應(yīng)，表現(xiàn)為自發(fā)抬足、舔咬足行為，持續(xù)時(shí)間超過(guò)60min。sham組大鼠則無(wú)自發(fā)痛反應(yīng)。蜜蜂毒組大鼠注射蜜蜂毒后1d、3d、7d均產(chǎn)生了明顯的熱痛敏和機(jī)械痛

7、敏(P<0.05)，注射后1d為痛覺(jué)過(guò)敏的高峰，3d、7d逐漸減弱。
　　 免疫組化染色顯示，與sham組相比，大鼠在注射蜜蜂毒后1h，L5脊髓節(jié)段后角小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和OX-42的表達(dá)未見明顯變化。在注射蜜蜂毒后1d時(shí)，可見小膠質(zhì)細(xì)胞胞體開始變大，細(xì)胞突起增粗，OX-42的表達(dá)顯著升高(P<0.05)。小膠質(zhì)細(xì)胞OX-42的表達(dá)和形態(tài)變化在注射后3d達(dá)到高峰。注射后7d表達(dá)依然明顯，但較之3d時(shí)有所減弱。以上結(jié)果表明，脊髓后角小

8、膠質(zhì)細(xì)胞受到蜜蜂毒炎性痛的刺激后明顯激活，其動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)為：1d開始明顯，3d達(dá)到高峰，7d開始減弱。
　　 2、NMDA受體抑制劑MK-801對(duì)大鼠蜜蜂毒炎性痛所致脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響
　　 方法：雄性Sprague-Dawley大鼠25只，體重230～270g，隨機(jī)分為以下5組(n=5)：①sham組：大鼠足底注射NS50μl。②蜜蜂毒組：大鼠足底注射蜜蜂毒溶液50μl(4gL-1)。③蜜蜂毒+MK-801組

9、：MK-801溶液10μl(50nmol)注入大鼠椎管內(nèi)，間隔15min后大鼠右后足底皮下注射蜜蜂毒溶液50μl(4gL-1)。④蜜蜂毒+NS組：生理鹽水10μl注入大鼠椎管內(nèi)，間隔15min后，大鼠右后足底皮下注射蜜蜂毒溶液50μl(4gL-1)。⑤sham+MK-801組：MK-801溶液10μl(50nmol)注入大鼠椎管內(nèi)，間隔15min后，大鼠右后足底皮下注射生理鹽水50μl。
　　 測(cè)定所有大鼠足底注射后60min內(nèi)

10、的自發(fā)痛反應(yīng)，并于注射后3d時(shí)測(cè)定熱痛敏和機(jī)械痛敏。之后，深麻醉下灌注后，取腰5(L5)脊髓節(jié)段，冰凍切片后，應(yīng)用免疫組化技術(shù)，觀察脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)和OX-42蛋白的表達(dá)量。上一組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在注射蜜蜂毒后3d，大鼠L5脊髓節(jié)段后角小膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)最明顯，所以本組實(shí)驗(yàn)選取足底注射后3d的時(shí)間點(diǎn)，觀察NMDA受體抑制劑MK-801對(duì)脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示。用社會(huì)

11、科學(xué)統(tǒng)計(jì)程序(StatisticalProgramforSocialSciences13.0)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-WayANOVA)，比較組間差異。有顯著差異者用最小顯著差法進(jìn)行兩兩比較，判斷差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。
　　 結(jié)果：蜜蜂毒組大鼠在足底注射蜂毒后產(chǎn)生明顯的自發(fā)痛行為反應(yīng)，與sham組相比，其痛行為評(píng)分明顯增高(P<0.05)。而在蜜蜂毒+MK-801組，給予MK-801明顯抑制了蜜蜂毒引起的

12、痛行為評(píng)分增高(P<0.05)。蜜蜂毒組大鼠的熱痛覺(jué)潛伏期和機(jī)械縮足閾值明顯下降(P<0.05)，而在蜜蜂毒+MK-801組，給予MK-801明顯抑制了蜜蜂毒引起的熱痛覺(jué)潛伏期和機(jī)械縮足閾值的下降(P<0.05)。
　　 免疫組化染色顯示，大鼠注射蜜蜂毒后3d，脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞較sham組明顯激活，其OX-42表達(dá)顯著升高(P<0.05)。椎管內(nèi)注射MK-801對(duì)足底注射蜜蜂毒引起的脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞的激活有明顯抑制作用，表現(xiàn)

13、為與蜜蜂毒組相比，其OX-42的表達(dá)明顯下降(P<0.05)，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)明顯減輕。椎管內(nèi)注射MK-801對(duì)sham大鼠脊髓后角OX-42的表達(dá)和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)無(wú)明顯影響。以上結(jié)果表明NMDA受體抑制劑MK-801對(duì)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的激活產(chǎn)生了抑制作用。
　　 結(jié)論：本研究應(yīng)用免疫組化方法發(fā)現(xiàn)，蜜蜂毒引起的炎性痛導(dǎo)致脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化；NMDA受體抑制劑MK-801可明顯抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，并有效抑制了