Rac1信號(hào)通路在糖尿病腎病足細(xì)胞損傷中的作用研究.pdf

1、背景:
　　Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate1，Rac1)是Rho家族小G蛋白成員之一，在細(xì)胞粘附，增殖以及細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)等一系列細(xì)胞生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。過度激活的Rac1參與氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)等病理過程，與糖尿病腎病的發(fā)病及病情發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，在一定損傷下足細(xì)胞可能通過上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymaltr

2、ansition，EMT)這一機(jī)制發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致足細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能紊亂、腎小球?yàn)V過膜的破壞以及蛋白尿的發(fā)生。而Rac1可能通過活化p21活化激酶1(p21-activated kinase1，PAK1)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated proteinkinase，MAPK)等下游重要的效應(yīng)激酶參與腫瘤細(xì)胞EMT過程。P38 MAPK為MAPK家族成員之一，參與產(chǎn)生炎癥介質(zhì)及調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架穩(wěn)定性。本課題組前期研究發(fā)

3、現(xiàn)，高糖環(huán)境可通過激活p38 MAPK誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，參與糖尿病腎病腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展，而靶向p38MAPK的重組質(zhì)?？捎行Ц蓴_p38MAPK基因表達(dá)，阻斷EMT的發(fā)生。因此，本研究以條件永生化小鼠足細(xì)胞系及構(gòu)建足細(xì)胞特異性Rac1 RNAi轉(zhuǎn)基因小鼠(transgenic mice，TG mice)作為研究對(duì)象，觀察并探討Rac1/PAK1/p38 MAPK信號(hào)通路的激活在高糖刺激誘導(dǎo)的足細(xì)胞EMT及糖尿病腎病蛋白尿發(fā)

4、生過程中的作用機(jī)制，Rac1信號(hào)通路與EMT中重要轉(zhuǎn)錄因子β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的相互關(guān)系，以及靶向抑制足細(xì)胞Rac1活性水平對(duì)糖尿病腎病足細(xì)胞損傷以及蛋白尿的保護(hù)作用，為臨床早期預(yù)防和治療糖尿病腎病提供新的理論依據(jù)和新的思路。
　　第一部分 Rac1在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化中的作用機(jī)制
　　目的:
　　1.明確高糖環(huán)境是否導(dǎo)致足細(xì)胞發(fā)生EMT。
　　2.明確足細(xì)胞發(fā)生EMT是否導(dǎo)致其功能

5、障礙，影響其屏障功能。
　　3.探討Rac1信號(hào)通路參與高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞EMT的發(fā)生機(jī)制。
　　4.探討調(diào)控Rac1信號(hào)通路對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞EMT的影響。
　　方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng):體外培養(yǎng)永生化小鼠足細(xì)胞系（由哈佛醫(yī)學(xué)院Peter Mundel教授惠贈(zèng)，北京大學(xué)丁潔教授轉(zhuǎn)贈(zèng)）。在Ⅰ型膠原包被的培養(yǎng)瓶內(nèi)，在條件下，用RPMI1640（10％胎牛血清）+10 U/ml重組小鼠γ-干擾素，于33℃培養(yǎng)足細(xì)胞增殖

6、;用不含γ-干擾素培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)足細(xì)胞14天促進(jìn)其分化成熟。
　　2.檢測(cè)高糖(30mmol/l)刺激前后足細(xì)胞EMT指標(biāo)及足細(xì)胞功能:(1)倒置相差顯微鏡明確足細(xì)胞形態(tài)學(xué)是否變化;(2) western blot、real time PCR及細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)足細(xì)胞標(biāo)志蛋白p-cadherin、ZO-1及間充質(zhì)細(xì)胞樣表型標(biāo)志物FSP-1、α-SMA、desmin的表達(dá)變化;(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)高糖培養(yǎng)條件下足細(xì)胞凋亡情況;(4)

7、 Transwell小室檢測(cè)白蛋白流入量，評(píng)價(jià)足細(xì)胞的單層屏障功能;(5) Transwell檢測(cè)足細(xì)胞遷移率以及FITC-鬼筆環(huán)肽(FITC-phailoidin)染色鑒定足細(xì)胞F-actin細(xì)胞骨架變化。
　　3.Rac1/PAK1/p38 MAPK信號(hào)通路檢測(cè):(1) Rac1 shRNA載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及基因敲低效率的鑒定:①熒光顯微鏡觀察陽性轉(zhuǎn)染率;②western blot及realtime PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后足細(xì)胞Ra

8、c1蛋白及mRNA表達(dá)水平;(2)抑制劑IPA-3及SB203580的配制:將粉末試劑溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)配制成儲(chǔ)存液，保存于-20℃。用于處理細(xì)胞時(shí)，首先以DMSO進(jìn)一步稀釋，然后計(jì)算加入體積確保培養(yǎng)基內(nèi)抑制劑終濃度為10μM;(3) GST Pull-down assay檢測(cè)Rac1活性;(4) western blot檢測(cè)不同處理組足細(xì)胞內(nèi)PAK1及p38 MAPK磷酸化水平。
　

9、　4.檢測(cè)調(diào)控Rac1信號(hào)通路對(duì)足細(xì)胞EMT及功能的影響:(1)檢測(cè)調(diào)控Rac1信號(hào)通路后足細(xì)胞EMT指標(biāo)及功能變化;(2) western blot、細(xì)胞免疫熒光等檢測(cè)不同處理組轉(zhuǎn)錄因子β-catenin、Snail表達(dá)水平變化。(3)明確Rac1信號(hào)通路與β-catenin的相互作用:①構(gòu)建激活型Rac1(CA-Rac1)、野生型Rac1(WT-Rac1)、失活型Rac1(DN-Rac1)三種Rac1表達(dá)質(zhì)粒;②構(gòu)建β-cateni

10、n表達(dá)質(zhì)粒(Flag-β-catenin)以及空對(duì)照質(zhì)粒;③共轉(zhuǎn)染Rac1表達(dá)質(zhì)粒與β-catenin表達(dá)質(zhì)粒;④免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，CO-IP）檢測(cè)Rac1/PAK1與β-catenin的相互作用;⑤體外激酶實(shí)驗(yàn)(in vito kinase assay)檢測(cè)p38 MAPK與β-catenin之間的相互作用。
　　結(jié)果:
　　1.高糖培養(yǎng)48小時(shí)后標(biāo)志性蛋白p-cadherin和ZO

11、-1表達(dá)明顯減少（P＜0.01）而間充質(zhì)樣蛋白FSP-1、α-SMA及desmin出現(xiàn)重新表達(dá)（P＜0.01）;Transwell小室白蛋白流入量顯著增加（P＜0.01），同時(shí)F-actin骨架蛋白出現(xiàn)明顯的邊集現(xiàn)象，伴隨足細(xì)胞遷移率顯著增高（P＜0.01）。
　　2.高糖刺激48小時(shí)導(dǎo)致了Rac1蛋白的激活(P＜0.01)，以及PAK1、p38MAPK磷酸化水平的增高（P＜0.01）;同時(shí)引起β-catenin的N端去磷酸化、S

12、nail表達(dá)增加（P＜0.05），以及β-catenin細(xì)胞核遷移。
　　3.Rac1 shRNA顯著抑制了足細(xì)胞EMT指標(biāo)的發(fā)生(P＜0.05)，部分修正了足細(xì)胞功能損傷(P＜0.05);同時(shí)明顯減少了PAK1、p38 MAPK磷酸化水平(P＜0.05)，降低了轉(zhuǎn)錄因子β-catenin、Snail活性（P＜0.05），并部分阻斷了β-catenin核遷移;抑制劑IPA-3及SB203580對(duì)Rac1活性均無顯著影響（P＞0.0

13、5），且SB203580對(duì)PAK1磷酸化無抑制作用（P＞0.05）。
　　4.Rac1對(duì)β-catenin的C端絲氨酸位點(diǎn)具有直接磷酸化修飾作用，這一作用導(dǎo)致β-catenin泛素化水平降低;同時(shí)，p38 MAPK通過磷酸化下游信號(hào)分子MEF2c來結(jié)合β-catenin。
　　結(jié)論:
　　1.高糖導(dǎo)致足細(xì)胞發(fā)生EMT及功能障礙。
　　2.Rac1通過激活下游信號(hào)分子PAK1/p38 MAPK參與高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞E

14、MT。
　　3.高糖條件下Rac1/PAK1/p38 MAPK信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子β-catenin活性與遷移，影響EMT相關(guān)基因及蛋白表達(dá)，從而導(dǎo)致足細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化。
　　4.調(diào)控Rac1/PAK1/p38 MAPK信號(hào)通路可阻斷足細(xì)胞EMT的發(fā)生
　　第二部分足細(xì)胞特異性Rac1 RNAi轉(zhuǎn)基因小鼠的建立與鑒定
　　目的:
　　構(gòu)建與鑒定足細(xì)胞特異性Rac1 RNAi TG小鼠。
　　方法

15、:
　　1.構(gòu)建足細(xì)胞特異性Rac1 shRNA載體:(1) PCR擴(kuò)增Nephrin啟動(dòng)子及mirRac1序列;(2)利用酶切連接構(gòu)建pUp-Nephrin和pDown-SM30/mirRac1;(3)利用gateway technology構(gòu)建pLV.EX2d.null-Nephrin＞SM30/mirRac1表達(dá)質(zhì)粒。
　　2.獲得足細(xì)胞特異的Rac1 RNAi TG小鼠:(1)建立F0小鼠:①利用酶切將載體進(jìn)行DNA

16、線性化并提純;②通過DNA顯微注射受精卵獲取新生小鼠;③基因分型PCR鑒定陽性者為已整合外源基因的TG小鼠F0;(2) F0小鼠與C57BL/6野生型小鼠雜交與傳代，鼠尾DNA提取及基因分型PCR篩選實(shí)驗(yàn)用TG小鼠。
　　3.靶向敲低Rac1效率鑒定:(1)免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)Rac1、synaptopodin在野生型(wide type，WT)與TG小鼠腎臟組織中的表達(dá);(2) western blot及real time PCR

17、檢測(cè)WT和TG小鼠原代足細(xì)胞中Rac1的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.獲得鼠尾DNA PCR產(chǎn)物陽性的足細(xì)胞特異TG小鼠。
　　2.Rac1蛋白在TG小鼠腎臟組織中表達(dá)明顯少于WT小鼠，而synaptopodin的表達(dá)不受外源基因整合的影響。
　　3.TG小鼠原代足細(xì)胞中Rac1蛋白和mRNA水平較WT小鼠顯著降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　成功構(gòu)建足細(xì)胞特異性Rac1 RNAi TG小鼠。

18、r>　　第三部分靶向抑制Rac1信號(hào)通路對(duì)糖尿病腎病足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
　　目的:
　　1.構(gòu)建野生型以及Rac1 RNAi轉(zhuǎn)基因糖尿病小鼠模型。
　　2.探討足細(xì)胞靶向抑制Rac1對(duì)糖尿病腎病足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。
　　3.探討足細(xì)胞靶向抑制Rac1對(duì)糖尿病腎病蛋白尿及腎臟的保護(hù)作用。
　　方法:
　　1.建立WT和TG糖尿病小鼠模型:(1)以鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(W

19、T-STZ/TG-STZ)，或無菌檸檬酸緩沖液進(jìn)行腹腔注射作為對(duì)照(WT-control/TG-control);(2)鼠尾靜脈采血測(cè)定血糖＞16.7mmol即為造模成功。
　　2.造模成功后4W-12W檢測(cè)指標(biāo):體重、收縮壓、血糖、24h尿蛋白定量等。
　　3.糖尿病腎臟病變檢測(cè):(1)透射電鏡測(cè)定足細(xì)胞數(shù)、足突融合率以及基底膜的平均厚度變異情況;(2)免疫熒光雙標(biāo)法或免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistr

20、y，IHC)測(cè)定足細(xì)胞裂孔膜(slit diaphragm，SD)蛋白p-cadherin和ZO-1，間充質(zhì)樣蛋白FSP-1、α-SMA、desmin及基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases，mmp9)的表達(dá)變化;(3) PAS染色觀察腎組織病理改變;(4) IHC檢測(cè)WT-1蛋白表達(dá)及足細(xì)胞凋亡情況。
　　4.GST pull-down檢測(cè)原代足細(xì)胞中Rac1蛋白活性;western blot檢測(cè)P

21、AK1及p38 MAPK磷酸化水平。
　　結(jié)果:
　　1.WT-STZ小鼠6W時(shí)電鏡示足細(xì)胞出現(xiàn)足突輕度融合;免疫熒光雙標(biāo)顯示SD蛋白p-cadherin和ZO-1表達(dá)開始降低，desmin表達(dá)增加;原代足細(xì)胞中Rac1蛋白活性顯著提高，PAK1與p38 MAPK磷酸化水平增加（P＜0.01）;8W時(shí)出現(xiàn)mmp9表達(dá)及蛋白尿（P＜0.05）;12W時(shí)足突明顯融合，mmp9表達(dá)及蛋白尿水平明顯加重（P＜0.01），同時(shí)出現(xiàn)FS

22、P-1重新表達(dá)。
　　2.各觀察時(shí)間段內(nèi)WT-STZ組體重分別較WT-control組顯著下降（P＜0.01）;4W-8W時(shí)TG-STZ組較WT-STZ組體重有所上升（P＜0.05）。
　　3.電鏡顯示各觀察時(shí)間段內(nèi)TG-STZ組均較WT-STZ組足突融合減輕;免疫熒光提示足細(xì)胞標(biāo)志指標(biāo)p-cadherin及ZO-1表達(dá)水平回升;desmin，mmp9與FSP-1明顯減少。
　　4.6W時(shí)TG-STZ較WT-STZ原代

23、足細(xì)胞GTP-Rac1表達(dá)減少，同時(shí)PAK1與p38 MAPK磷酸化水平顯著減少（P＜0.05）。
　　5.各觀察時(shí)間段TG-STZ組均較WT-STZ組蛋白尿顯著減少（P＜0.05），同時(shí)PAS示腎小球基底膜(glomerular basement membrane，，GBM)與系膜區(qū)病變程度降低。
　　6.各觀察時(shí)間段TG-STZ與WT-STZ小鼠血糖血壓無顯著差別(P＞0.05);四組組間足細(xì)胞數(shù)量無顯著差異（P＞0.0