OGD誘導dsRNA活化NLRP3信號通路及其相關(guān)炎性因子在腦損傷中的作用機制.pdf

1、缺血性腦損傷根本病理改變是神經(jīng)元損害，是導致患者殘死率高的核心原因之一。而神經(jīng)元損害除了細胞接受外源刺激導致蛋白表達和信號通路異常，細胞內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達改變也逐漸被發(fā)現(xiàn)是細胞損傷的關(guān)鍵因素。近年來，研究發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA(double-stranded，dsRNA)可能是一種危險信號，通過細胞危險信號模式應(yīng)答，引起細胞反應(yīng)直至細胞凋亡。但dsRNA是否作為一種內(nèi)源性危險信號真正參與神經(jīng)元損害，以及具體的調(diào)控機制尚不清楚，急需深入研究。因此

2、，本實驗的研究目標是探索dsRNA在缺血性腦損傷中的作用和調(diào)控機制。
　　實驗一、OGD誘導HT22細胞產(chǎn)生B1 RNA形式的dsRNA
　　目的：驗證HT22細胞氧糖剝奪后產(chǎn)生內(nèi)源性dsRNA,明確dsRNA的組成成分和序列。
　　方法：
　　1.培養(yǎng)建立HT22細胞的OGD（氧糖剝奪）模型，建立體外神經(jīng)元細胞缺血性模型。光鏡下觀察細胞生長情況，神經(jīng)元細胞成熟后OGD處理，光鏡下觀察細胞形態(tài)，檢測LDH（乳酸脫

3、氫酶）活性，評價損傷模型。
　　2.免疫熒光標記dsRNA的表達。利用特異性結(jié)合dsRNA的J2抗體標記，DAPI染核，熒光顯微鏡下觀察Merge圖像。
　　3.建立dsRNA的cDNA文庫，與小鼠B1 RNA序列比對。通過IP，qRT-PCR，反轉(zhuǎn)錄PCR，T-A克隆，瓊脂糖核酸凝膠電泳實驗，測序分析。
　　結(jié)果：
　　1.光鏡下觀察OGD6小時后的HT22，細胞核膜形態(tài)發(fā)生變化，細胞縮小，細胞體腫脹，核固縮，

4、空泡樣疏松化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡和線粒體腫脹。細胞損傷加劇。HT22細胞在OGD處理后與對照組相比較，LDH活性明顯升高。OGD模型建立成功。
　　2.熒光顯微鏡下清晰可見與J2抗體結(jié)合的dsRNA，在OGD24小時組較之空白對照組明顯增加，主要分布在核周胞質(zhì)內(nèi)。
　　3.測序分析發(fā)現(xiàn)，OGD后產(chǎn)生的dsRNA與小鼠B1 RNA序列是相似的，而OGD后產(chǎn)生的dsRNA主要是215bp的B1 RNA。與小鼠的B1以及B1 DNA序

5、列是一致的。瓊脂糖核酸凝膠電泳實驗和qRT-PCR實驗中dsRNA的主要成分為B1 RNA。結(jié)論：HT22細胞在OGD處理后，細胞內(nèi)產(chǎn)生的dsRNA的主要組成為B1 RNA，其與小鼠B1序列一致。
　　實驗二、B1 RNA和NLRP3在OGD作用以及MCAO模型小鼠原代神經(jīng)元細胞中的表達
　　目的：離體小鼠大腦皮層神經(jīng)元OGD模型和在體小鼠MCAO（小鼠大腦中動脈栓塞）模型中確認B1 RNA的產(chǎn)生以及NLRP3炎性通路的激活

6、。
　　方法：
　　1.小鼠原代神經(jīng)元OGD模型和小鼠MCAO模型建立。光鏡下觀察OGD后神經(jīng)元的形態(tài)，LDH活性測定，小鼠神經(jīng)功能評分，TTC染色。
　　2.qRT-PCR檢測小鼠-神經(jīng)元細胞B1 RNA和NLRP3的表達。Western blot檢測NLRP3的表達。pcDNA3.1-B1轉(zhuǎn)染小鼠大腦皮層原代神經(jīng)元細胞，通過MTS實驗，qRT-PCR，Western blot實驗分別檢測B1 RNA轉(zhuǎn)錄和NLRP3

7、的表達。
　　結(jié)果：
　　1.與正常的原代神經(jīng)元對比，OGD作用2h后可見神經(jīng)元細胞損傷，軸突變短甚至消失。神經(jīng)元細胞在OGD處理后與對照組相比較，LDH活性明顯升高。神經(jīng)功能評分顯示MCAO小鼠神經(jīng)功能異常，TTC染色顯示MCAO小鼠大腦出現(xiàn)蒼白色缺血區(qū)域，模型建立成功。
　　2.免疫熒光顯示MCAO小鼠神經(jīng)元細胞中dsRNA和NLRP3表達顯著。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示小鼠MCAO后B1和N

8、LRP3表達升高。OGD組和pcDNA3.1-B1實驗組，NLRP3蛋白表達量顯著高于對照組。而pcDNA3.1-B1+siNLRP3實驗組，NLRP3的蛋白表達量顯著低于pcDNA3.1-B1實驗組。同時，OGD+siNLRP3實驗組，NLRP3的蛋白表達量顯著低于OGD組。該結(jié)果提示，在我們的實驗中成功干涉了OGD以及B1 RNA誘導的NLRP3表達。MTS實驗顯示OGD作用以及轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-B1，可顯著抑制小鼠原代神經(jīng)元細

9、胞的生長，。干涉OGD和pcDNA3.1-B1組小鼠原代神經(jīng)元細胞中 NLRP3的表達可改善細胞的生長活性。
　　結(jié)論：OGD模型以及小鼠MCAO模型中，小鼠大腦皮層原代神經(jīng)元細胞B1 RNA和NLRP3在表達上調(diào)。B1 RNA和NLRP3的增多可抑制小鼠大腦皮層原代神經(jīng)元細胞的生長。
　　實驗三、B1 RNA以及NLRP3通路調(diào)控的炎性因子在OGD模型HT22細胞中的表達及關(guān)系
　　目的：研究B1與NLRP3通路調(diào)控

10、的炎性因子在缺血性腦損傷中的表達。
　　方法：通過Western blot，qRT-PCR，ELISA等實驗檢測OGD作用、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-B1和pcDNA3.1-B1+siNLRP3后，HT22細胞中NLRP3，IL-1β，TNF-α的表達量。MTS實驗和ELISA實驗同樣用來檢測轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-B1質(zhì)粒和pcDNA3.1-B1+siNLRP3后的細胞活性以及各種促炎因子的表達。
　　結(jié)果：Western bl

11、ot顯示NLRP3表達量隨OGD時間延長而增加；qRT-PCR顯示OGD后HT22細胞中的NLRP3通路被活化；ELISA顯示HT22細胞OGD后從12小時開始IL-1β和TNF-α的表達量開始升高。轉(zhuǎn)染B1后的HT22細胞NLRP3表達升高。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-B1的HT22細胞中NLRP3、IL-1β和TNF-α三個炎性因子的表達較對照組和空質(zhì)粒組升高。ELISA結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-B1的HT22細胞中IL-1β和TN