沙田柚花粉管蛋白及花粉同工酶的生化分析.pdf

1、本研究探討了沙田柚(Citrus grandis var.Shatinyu Hort.)花粉離體(in vitro)萌發(fā)的優(yōu)化條件；對超聲波破碎花粉管提取其可溶性蛋白的方法也進行了研究；并且利用了靈敏度高、樣品需求量少的雙向電泳結合銀染技術,對沙田柚花粉自交、異交條件下離體萌發(fā)的花粉管可溶性蛋白的電泳格局的差異進行了分析；另外,還分析了沙田柚成熟花粉萌發(fā)前后三種同工酶(即過氧化物酶、酯酶、淀粉酶)的類型和活力變化的情況。為沙田柚配子體自

2、交不親和性在雄蕊方面的研究提供了一些新的實驗證據(jù),并且為最終分離、鑒定沙田柚花粉S蛋白打下了基礎。研究結果發(fā)現(xiàn)貯藏時花粉的含水量、撒播密度對花粉萌發(fā)率和萌發(fā)速度的影響至關重要。所貯藏花藥的含水量保持在11.0~12.5%范圍內,每個加有1.5ml培養(yǎng)液的凹面皿(？5㎝)中,一般花粉的撒播量為8~12個花藥,或者每片滴加0.5ml培養(yǎng)液的載玻片上,花粉的撒播量為6~8個花藥；培養(yǎng)溫度28~30℃,這種情況下培養(yǎng)的花粉,其萌發(fā)率最高,可達到

3、80~90%的萌發(fā)率。另外,蔗糖的含量在10~20%之間條件下,花粉的萌發(fā)均較好。其中以12%蔗糖濃度的BKS培養(yǎng)液作為花粉管培養(yǎng)基,花粉不僅有較好的萌發(fā)率,花粉管也長得較整齊。SDS-PAGE檢測利用超聲波破碎花粉管提取其可溶性蛋白的效果,結果表明：與常規(guī)研磨法相比,超聲波提取法結果穩(wěn)定、可靠性強、操作簡便、大大縮短提取時間。經過比較,以選用600W功率,超聲時間3s/次,間歇時間6s/次,分三個回合共工作120次,每回合之間相隔10

4、分鐘的組合效果最好。采用這一組參數(shù)進行超聲波破碎花粉管以提取其可溶性蛋白時,鏡檢發(fā)現(xiàn)90%的花粉管斷裂成碎片,但花粉粒幾乎沒有被破碎。對沙田柚自交、異交條件下花粉管可溶性蛋白的電泳結果進行分析和比較,結果發(fā)現(xiàn),在SDS-PAGE單向電泳圖譜上檢測到自交條件下相對分子量為22.0ku和32.5ku的兩條帶不同于異交條件下蛋白圖譜；而異交下條件下出現(xiàn)了分子量為44.8ku的差異蛋白。在IEF-PAGE的圖譜上,檢測到pI為5.85和6.20

5、的條帶為自交花粉管的特異蛋白譜帶。對自交、異交條件下的花粉管可溶性蛋白的IEF/SDS-PAGE雙向電泳圖譜分析也確定了相似于單向電泳上的特異蛋白帶的蛋白斑點。比較分析沙田柚自交、異交花粉管蛋白的雙向電泳圖譜,兩者的蛋白分布格局相似,具有重疊性,可分辨出200多個蛋白點。在已知花柱與自交不親和有關的蛋白處于的pI范圍5.00~7.50之間,考察該范圍內自交、異交條件下的蛋白點的變化或差異情況,多次重復實驗的結果發(fā)現(xiàn)：在異交花粉管電泳圖譜

6、中出現(xiàn)了1種特異蛋白(A),A蛋白(MrA=58.2ku,pI=5.90)；在自交花粉管電泳圖譜中出現(xiàn)了2種特異蛋白(B、C),B蛋白(MrB=26.4ku,pI=6.10),C蛋白(MrC=28.0ku,pI=6.30),這些蛋白可能是沙田柚花粉管中與自交不親和有關的蛋白。鑒于現(xiàn)有的關于配子體型自交不親和性的兩種模型學說,我們的結果從一個方面支持了“核酸酶抑制劑”模型。沙田柚花粉萌發(fā)前后同工酶變化分析結果顯示：萌發(fā)前后花粉的過氧化物酶