梨花粉管停止生長(zhǎng)與線粒體的關(guān)系研究.pdf

1、線粒體變化及其在花粉管亞尖端的富集對(duì)滿足花粉管高速極性生長(zhǎng)過程中巨大的能量需求和分配極其重要。但是，在花粉管停止生長(zhǎng)過程中，線粒體作用特點(diǎn)尚不清楚。本研究以梨品種‘黃花’、‘豐水’及‘碭山酥梨’為試材，綜合應(yīng)用免疫熒光標(biāo)記、激光共聚焦顯微鏡、透射電鏡、亞細(xì)胞器制備分離等技術(shù)手段，研究了線粒體對(duì)離體培養(yǎng)梨花粉管衰老和死亡的作用特點(diǎn)，主要結(jié)果如下:
　　1.探明了梨自花花粉管線粒體呼吸代謝及可溶性蛋白變化。結(jié)果表明，梨自花花粉管呼吸氧

2、消耗量顯著降低。對(duì)提純的自花花粉管線粒體呼吸鏈進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其呼吸控制比率明顯下降。這些結(jié)果表明自花花粉管線粒體功能發(fā)生紊亂。采用二維電泳對(duì)自花花粉管線粒體可溶性蛋白進(jìn)行了分析，自花花粉管線粒體與異花花粉管線粒體可溶性蛋白共匹配了70個(gè)蛋白點(diǎn)，具有顯著性差異的蛋白點(diǎn)為18個(gè)，其中上調(diào)的為7個(gè)，下調(diào)的為11個(gè)。
　　2.明確了離體梨花粉從萌發(fā)到生長(zhǎng)停止，這一發(fā)育過程屬于植物器官衰老。揭示了梨花粉管生長(zhǎng)發(fā)育過程涉及衰老并最終死亡過程由

3、胞質(zhì)酸化誘導(dǎo)的線粒體功能紊亂介導(dǎo)。梨花粉水合后0～9h，花粉管維持較高生長(zhǎng)速率，到15h后，生長(zhǎng)基本停止。FDA染色顯示停止生長(zhǎng)的花粉管已失去活力。以植物衰老的生理及細(xì)胞學(xué)指標(biāo)對(duì)停止生長(zhǎng)的梨花粉管進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，衰老的花粉管丙二醛含量和電解質(zhì)滲漏率明顯升高。在細(xì)胞水平上，觀測(cè)到衰老的梨花粉管內(nèi)微絲骨架大量解聚，細(xì)胞核DNA降解。在衰老的梨花粉管中，V-ATPase活性降低導(dǎo)致胞質(zhì)酸化。胞質(zhì)酸化可以直接誘導(dǎo)線粒體功能衰退，其中包括線粒

4、體內(nèi)部脊結(jié)構(gòu)紊亂、溶脹，呼吸氧消耗及ATP產(chǎn)生下降，膜電位下降等。此外，用線粒體膜電位去極化試劑纈氨霉素處理花粉管，使線粒體功能衰退，從而誘導(dǎo)了花粉管細(xì)胞核降解。該藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了線粒體功能受到破壞可以導(dǎo)致花粉管細(xì)胞核降解。
　　3.明確了梨花粉管尖端活性氧主要來源為質(zhì)膜NADPH氧化酶。結(jié)果表明，NaN3處理顯著抑制了梨花粉管線粒體呼吸功能，但是線粒體呼吸功能的失調(diào)并不能完全消除花粉管尖端活性氧，這說明線粒體可能不是花粉管

5、尖端活性氧的主要貢獻(xiàn)者。但是，NADPH氧化酶抑制劑DPI基本能清除尖端活性氧，此外，發(fā)現(xiàn)低溫處理誘導(dǎo)了花粉管尖端活性氧顯著下降。同時(shí)深入研究，成功克隆了梨花粉管NADPH氧化酶基因（PrRBOH）全長(zhǎng)，其編碼氨基酸序列具有植物RBOHs家族蛋白功能域。熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，低溫處理后，花粉管內(nèi)PrRBOH呈現(xiàn)低表達(dá)量。這些結(jié)果說明，梨花粉管尖端ROS主要調(diào)控因子是NADPH氧化酶。
　　4.探明了低溫通過抑制線粒體能量代謝

6、功能，從而調(diào)控花粉管胞吞作用，最終抑制梨花粉管生長(zhǎng)的過程。在低溫條件下，花粉管生長(zhǎng)通常被抑制。在花粉管快速生長(zhǎng)過程中，需要線粒體產(chǎn)生足夠的能量以滿足胞內(nèi)各種代謝活動(dòng)需求。其中，花粉管伸長(zhǎng)所需要的細(xì)胞壁合成物質(zhì)通常經(jīng)囊泡運(yùn)輸?shù)揭欢ㄎ恢?，這一過程需要大量ATP。本章研究從線粒體能量代謝角度深入探討了其在低溫條件下調(diào)控梨花粉管生長(zhǎng)特點(diǎn)。結(jié)果顯示，4℃低溫完全抑制了梨花粉管生長(zhǎng)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，低溫導(dǎo)致了花粉管尖端胞吞作用停止，線粒體呼吸作用降