Semaphorin3F對大鼠海馬神經(jīng)元軸突生長錐作用的研究.pdf

1、目的：癲癇是一種以短暫的腦功能失常為特征的慢性腦部疾病，是由于腦內(nèi)神經(jīng)元的過度放電所致。癲癇的發(fā)病機(jī)制目前仍未明確，研究表明，在分子水平，苔蘚纖維出芽(Mossy Fiber Sprouting，MFS)是癲癇發(fā)作后一種最常見的病理改變。Semaphorin家族是一類腦信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，MFS的發(fā)生發(fā)展與Semaphorin家族的表達(dá)異常具有一定的相關(guān)性。Semaphorins3F（Sema3F）是 Semaphorins家族中的一員，在神

2、經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)是最具有特征性，尤其在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中。Sema3F在全身各部位均有表達(dá)，但Sema3F的受體neuropilin-2僅在海馬存在。通過計(jì)劃對大鼠海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)，對原代海馬神經(jīng)元給予不同濃度的Sema3F干預(yù)，觀察在不同作用時(shí)間，不同濃度Sema3F干預(yù)后，大鼠海馬神經(jīng)元軸突生長錐的變化，了解Sema3F對海馬神經(jīng)元的作用，以及時(shí)間及濃度的相關(guān)性。為診斷和治療與Sema3F相關(guān)的疾病尋找出理論依據(jù)，從而為神經(jīng)系統(tǒng)疾病

3、，如難治性癲癇，神經(jīng)損傷再修復(fù)等提供發(fā)病機(jī)制及治療靶點(diǎn)。
　　方法：提取出生24小時(shí)內(nèi)新生SD大鼠海馬神經(jīng)元的原代細(xì)胞，采用無血清培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，鑒定海馬神經(jīng)元的純度。分別給予不同濃度的Sema3F干預(yù)，使用倒置顯微鏡，觀察不同濃度的Sema3F干預(yù)后，在不同時(shí)間海馬神經(jīng)元軸突的變化。了解Sema3F的生理學(xué)功能。
　　結(jié)果：剛接種時(shí)，海馬神經(jīng)元的原代細(xì)胞呈圓形，培養(yǎng)30分鐘后，觀察到細(xì)胞開始貼壁，大部分細(xì)胞在2小時(shí)

4、后均貼壁，從圓形變?yōu)闄E圓形，后逐漸出現(xiàn)1到2個(gè)突起。培養(yǎng)至第2天神經(jīng)元胞體增大，呈現(xiàn)多種形態(tài)，如橢圓形、三角形、多邊形等，胞質(zhì)豐富，突起明顯延長，數(shù)量增多，形態(tài)多樣。培養(yǎng)至第3天，神經(jīng)元胞體進(jìn)一步增大、變形，突起進(jìn)一步延伸，相互連接呈像絲帶狀，多個(gè)神經(jīng)元連接在一起形成神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)。后神經(jīng)元不斷分化成熟，培養(yǎng)至11天，神經(jīng)元開始聚集成團(tuán)塊狀神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)變稠密，16天后，神經(jīng)元開始退化，細(xì)胞數(shù)目逐漸減少。應(yīng)用神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)鑒定培

5、養(yǎng)神經(jīng)元的純度大于95％。依據(jù)神經(jīng)元形態(tài)變化的規(guī)律，在培養(yǎng)3天的新生大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)基中加入不同濃度的Sema3F，在不同作用時(shí)間觀察大鼠海馬神經(jīng)元軸突生長錐的變化，發(fā)現(xiàn) Sema3F可導(dǎo)致大鼠海馬神經(jīng)元軸突生長錐的塌陷，并隨著時(shí)間及濃度的增加塌陷比例增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：提取新生24小時(shí)內(nèi)的SD大鼠海馬神經(jīng)元，采用無血清培養(yǎng)技術(shù)聯(lián)合細(xì)胞培養(yǎng)添加劑B27可以成功培養(yǎng)出了高純度的海馬神經(jīng)元。選擇神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物