神經(jīng)元特異性基因mLRRC4是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育與軸突生長的功能基因.pdf

1、1985年日本人Takahashi在人血清富含亮氨酸的α-糖蛋白中發(fā)現(xiàn)LRR結(jié)構(gòu)域(leucine-richrepeat)，包含LRR結(jié)構(gòu)域的蛋白存在于從酵母到人的多個物種，在多種細(xì)胞的不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上定位，具有不同的生理功能?，F(xiàn)在被識別的LRR蛋白家族成員已經(jīng)有四千多種。這種蛋白結(jié)構(gòu)基序的最基本功能是為蛋白質(zhì)的交互作用提供通用的結(jié)構(gòu)框架。 研究表明一些LRR蛋白家族成員在果蠅神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中扮演著重要角色。比如connecti

2、n與神經(jīng)肌肉連接形成相關(guān)，slit參與軸突的發(fā)育，chaopin參與視桿細(xì)胞發(fā)育，tartan在神經(jīng)和肌肉發(fā)育中發(fā)揮作用。近來在脊椎動物中也發(fā)現(xiàn)一些包含LRR和Ig結(jié)構(gòu)的蛋白如LIG-1、LRRN6A、NGL-1在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中時序性表達(dá)。hLRRC4(Homosapiensleucinerichrepeatcontaining4，hLRRC4，登錄號：AF196976)是我室運用EST介導(dǎo)的定位候選克隆方法結(jié)合RACE技術(shù)從染色體

3、7q31成功克隆的一個富亮氨酸重復(fù)超家族新成員。生物信息學(xué)分析表明hLRRC4基因編碼653個氨基酸，核心區(qū)域由9個串聯(lián)的LRR結(jié)構(gòu)和包圍它們的富含半胱氨酸的N端和C端LRR構(gòu)成，此外還含有1個C2型免疫球蛋白(IgC2)結(jié)構(gòu)域。 基于LRRC4的結(jié)構(gòu)，我們推測LRRC4可能與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育相關(guān)，然而考慮到道德因素和取材困難，我們不能用人來進行試驗。因此我們克隆了與hLRRC蛋白相似性高達(dá)97％的小鼠的LRRC4基因，詳細(xì)考察了

4、mLRRC4在不同發(fā)育階段小鼠個體中的表達(dá)情況，并用突起生長實驗證明LRRC4促進神經(jīng)突起生長，推測LRRC4基因可能參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育與正常功能的維持。 克隆小鼠LRRC4基因用生物信息學(xué)技術(shù)結(jié)合RT-PCR方法克隆了小鼠LRRC4基因并在基因GenBank登錄(登錄號：DQ177325)。新基因包含1959個堿基的開放閱讀框，在起始密碼子前有同框終止密碼子。mLRRC4編碼一個含有652個氨基酸的跨膜蛋白，后者分子量為72.

5、6kDa，等電點為6.58。mLRRC4的胞外部分含有一段信號肽，核心部分由富含半胱氨酸的氮端和碳端結(jié)構(gòu)域包裹9個LRR結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，在靠近跨膜區(qū)還含有一個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。 將mLRRC4的LRR結(jié)構(gòu)域進行多序列比對，每個LRR結(jié)構(gòu)域都含有24個氨基酸殘基。它們的一致序列為LxxLxLxxnxixxixxxaFxxLxx。 同時我們用電子克隆的方法克隆了大鼠LRRC4(登錄號：DQ119102)和牛LRRC4(登錄號：D

6、Q164537)。用mLRRC4蛋白序列進行同源性搜索表明，mLRRC4與人、大鼠、牛的相似性分別是97％、99％、96％，此外我們還發(fā)現(xiàn)mLRRC4的蛋白序列與斑馬魚有70％的相似性。LRRC4家族成員都含有高度保守的LRRNT-(LRRs)9-LRRCT-IgC2，而且這些串聯(lián)排列的結(jié)構(gòu)域具有高度的保守性。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)富含半胱氨酸的氮端和碳端結(jié)構(gòu)域在許多含LRR結(jié)構(gòu)域的粘附蛋白和受體中高度保守。由此可見，LRRC4可能是一

7、個高度保守的蛋白家族，在系統(tǒng)發(fā)生中發(fā)揮著重要的生理功能。 mLRRC4是神經(jīng)組織相對特異性基因提取成年小鼠各種組織的總RNA進行RT-PCR，結(jié)果顯示mLRRC4在成年小鼠的心、脾、肝、肺、肌肉、子宮、胃均沒有表達(dá)或表達(dá)很弱，而在30天和60天的腦組織中有高表達(dá)，是一個具有組織特異性的基因。 用原位雜交方法研究mLRRC4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)模式。mLRRC4mRNA散在地分布于整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其陽性信號主要存在于胞漿

8、，在某些細(xì)胞核周、胞核與突起中也有表達(dá)。在大腦皮層，mLRRC4在梨狀前皮質(zhì)后部，顳頁皮質(zhì)聽區(qū)、丘腦上輻射區(qū)表達(dá)。在海馬CA1、CA2區(qū)、齒狀回的顆粒細(xì)胞強陽性表達(dá)，在丘腦內(nèi)側(cè)背核表達(dá)強陽性。mLRRC4在整個小腦中均有表達(dá)，特別是在小腦顆粒層和蒲肯野細(xì)胞層表達(dá)較強。在脊髓中mLRRC4主要在灰質(zhì)表達(dá)。 為探討mLRRC4是在神經(jīng)元細(xì)胞還是在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，我們首先用mLRRC4探針對切片進行原位雜交，然后利用膠質(zhì)細(xì)胞纖維酸

9、性蛋白(GFAP)抗體進行免疫組化實驗，用堿性磷酸酶顯色底物(BCIP/NBT)顯色。結(jié)果顯示，mLRRC4只在神經(jīng)元中表達(dá)，而在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中沒有表達(dá)。 用原位雜交結(jié)合免疫熒光技術(shù)也同樣證明mLRRC4在神經(jīng)元表達(dá)。星型膠質(zhì)細(xì)胞主要存在于小腦的髓質(zhì)和皮質(zhì)顆粒層，神經(jīng)元主要存在于蒲肯野細(xì)胞層和顆粒層，在分子層和髓質(zhì)分布的神經(jīng)元較少。mLRRC4在GFAP陰性的區(qū)域呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，顯示mLRRC4在神經(jīng)元胞體和突起中均有表達(dá)。這說明

10、mLRRC4是一個神經(jīng)元特異性基因。 mLRRC4在鼠腦發(fā)育不同時段的表達(dá)抽提了不同發(fā)育階段鼠腦的總RNA，并把它們轉(zhuǎn)換成cDNA，RT-PCR結(jié)果顯示了mLRRC4的mRNA在早期(E8.5)并不表達(dá)，E9.5天有表達(dá)，到E16.5天表達(dá)最高，此后mLRRC4的表達(dá)維持在一定水平。 mLRRC4探針整胎雜交結(jié)果在E12.5胚胎，mLRRC4探針分別在中腦、后腦、末腦等腦室和眼有明顯雜交信號。而用預(yù)雜交液替代探針和加入十

11、倍互補探針則沒有顏色反應(yīng)出現(xiàn)。 mLRRC4探針在胚胎切片組織中的表達(dá)狀況進一步用切片原位雜交方法考察mLRRC4在小鼠E12.5胚胎的表達(dá)情況，mLRRC4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)所有器官均表達(dá)陽性。其中前腦泡、中腦、后腦、末腦及脈絡(luò)叢、神經(jīng)管表達(dá)陽性。在背根神經(jīng)節(jié)表達(dá)強陽性。而其它組織如心臟、肝表達(dá)很低或沒有表達(dá)。在陰性對照中，沒有陽性信號。 mLRRC4在維甲酸誘導(dǎo)P19胚胎癌細(xì)胞分化過程中的表達(dá)狀況小鼠P19胚胎癌細(xì)胞在維

12、甲酸的誘導(dǎo)下能定向分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是體外進行哺乳動物神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育與分化分子機制的模型。用景乃禾教授贈予RA誘導(dǎo)P19分化模型各時段cDNA進行初步實驗。結(jié)果表明mLRRC4在P19細(xì)胞中沒有表達(dá)，在RA誘導(dǎo)第4天和分化階段有表達(dá)。在P19誘導(dǎo)模型中，分化第1天即可檢測到神經(jīng)元特異性信號(如NSE等)的表達(dá)，到分化第7天開始檢測到膠質(zhì)細(xì)胞特異性信號(GFAP)表達(dá)，也就是說分化第一天開始出現(xiàn)神經(jīng)元，分化第7天開始出現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞。

13、因此，我們的結(jié)果提示mLRRC4可能參與了神經(jīng)元的早期形成和分化，這一結(jié)果也從另一方面佐證了mLRRC4是一神經(jīng)元特異性基因。 LRRC4促進海馬細(xì)胞軸突生長同時包含LRR與Ig結(jié)構(gòu)域的蛋白都被證明與軸突生長相關(guān)。膜蛋白LRRC4預(yù)測的蛋白結(jié)構(gòu)表明這種蛋白很可能象其它具有這種結(jié)構(gòu)的粘附分子一樣通過介導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用來促進神經(jīng)再生。我們運用Tsuji的軸突生長實驗方法來檢測LRRC4是否具有這一功能。 18.5天海馬被分