腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子前體對神經(jīng)元存活、軸突生長及Aβ代謝的影響.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)隱匿起病，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)多個重要區(qū)域呈逐漸進(jìn)展的退行性改變，是癡呆的主要病因。以β-淀粉樣蛋白(amyloid-beta，Aβ)為靶點的免疫治療臨床試驗近期宣告失敗，AD治療前景的嚴(yán)峻性和緊迫性日益突出，學(xué)者的目光開始重新回到AD相關(guān)機(jī)制的基礎(chǔ)研究，期望為AD的治療尋求突破。AD患者腦內(nèi)最具特點的組織學(xué)變化包含由神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白異常磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurof

2、ibrillary tangle，NFT)、細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)Aβ異常聚集和大量沉淀形成的老年斑(senile plaque，SP)、皮層和海馬等重要腦區(qū)內(nèi)的大量神經(jīng)元退化丟失，除此之外，神經(jīng)突觸的功能障礙也是AD病理發(fā)生中一個重要因素。參與AD發(fā)病機(jī)制和疾病進(jìn)程的因素較多，不可干預(yù)因素方面有老齡化等，其他方面有遺傳因素、環(huán)境因素、炎癥等因素，而高血壓和糖尿病等也是影響AD進(jìn)程的重要因素。研究較多的神經(jīng)營養(yǎng)素——腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)具

3、有非常重要的作用。我們認(rèn)為，BDNF在腦內(nèi)的酶解轉(zhuǎn)化異常和含量水平異?？赡芘cAD的發(fā)病和進(jìn)展有重要關(guān)系。已有研究發(fā)現(xiàn)，AD病人往往伴隨腦內(nèi)外BDNF水平的改變，并有假設(shè)提出將BDNF作為預(yù)測AD的生物學(xué)標(biāo)記物，但這種假設(shè)有待于更多的研究來證實。近年學(xué)者發(fā)現(xiàn)，作為BDNF前體蛋白的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子前體(brain-derived neurotrophic factor precursor, proBDNF)，其本身也具有生物活性，能夠影

4、響神經(jīng)細(xì)胞的多項生物功能。離體和在體實驗表明，proBDNF具有與其裂解產(chǎn)物成熟體BDNF(mamre BDNF，mBDNF)不同甚至相反的生物學(xué)作用，能夠通過p75神經(jīng)營養(yǎng)素受體(p75 neurotrophin receptor, p75NTR)等機(jī)制介導(dǎo)對神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用，引發(fā)神經(jīng)突觸功能障礙，甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。目前認(rèn)為，由前體蛋白的酶裂解轉(zhuǎn)化異常等原因?qū)е碌膒roBDNF/mBDNF比例失衡可能突顯了proBDNF的負(fù)性生物學(xué)

5、效應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)proBDNF的各種神經(jīng)毒性作用。因此，深入研究proBDNF對神經(jīng)細(xì)胞存活及其軸突的影響具有重要意義。
　　Aβ是構(gòu)成SP的主要成分，腦內(nèi)Aβ的代謝異常和異常沉積被認(rèn)為是AD發(fā)病機(jī)制中的始發(fā)因素和中心環(huán)節(jié)。目前認(rèn)為，大量Aβ異常沉積產(chǎn)生神經(jīng)毒性，還可促發(fā)神經(jīng)細(xì)胞反應(yīng)性產(chǎn)生Aβ，最終導(dǎo)致Aβ的產(chǎn)生與清除失衡，形成惡性循環(huán)。當(dāng)皮層和海馬等區(qū)域出現(xiàn)大量Aβ沉積及老年斑形成時，神經(jīng)元往往出現(xiàn)凋亡和丟失，進(jìn)而引發(fā)一系列高級認(rèn)

6、知功能的損害，即AD常見的記憶力減退、精神行為功能異常等表現(xiàn)。因此，如何能夠在維持神經(jīng)細(xì)胞功能的同時終止或減緩Aβ的繼續(xù)沉積是防治AD進(jìn)展的一個重要環(huán)節(jié)。
　　由于血腦屏障對多種藥物的屏蔽作用，關(guān)于AD相關(guān)神經(jīng)毒性的研究大多局限于離體條件下。采用腦內(nèi)或腦室內(nèi)立體定向注射技術(shù)能夠準(zhǔn)確將干預(yù)藥物遞送至腦內(nèi)，有效觀察在體情況下腦內(nèi)的病理變化進(jìn)程。研究表明，腦內(nèi)或腦室內(nèi)給予重組病毒等基因載體能夠有效轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞并表達(dá)，或給予低免疫原性抗體

7、等外源性物質(zhì)可被神經(jīng)細(xì)胞有效攝取和逆向轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，我們在本研究中采用重組抗裂解的proBDNF以及能夠表達(dá)此重組蛋白的腺相關(guān)病毒基因整合載體(adeno-associated virus-proBDNF,AAV-proBDNF)，以及腦內(nèi)Aβ沉積增加并即將出現(xiàn)行為學(xué)改變的適齡轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病小鼠(AD鼠，雌性，5月齡，APPswePSldE9):1.觀察離體情況下proBDNF對神經(jīng)元存活和突起生長的影響，探討p75NTR在其中可能的

8、介導(dǎo)作用;2.建立側(cè)腦室立體定向注射方法，檢測AAV-proBDNF注射后不同時期重組proBDNF蛋白在AD鼠腦內(nèi)的表達(dá)情況;3.研究在體情況下proBDNF對AD鼠學(xué)習(xí)記憶功能和腦內(nèi)Aβ代謝的影響，以及p75NTR在其中可能的介導(dǎo)作用。
　　一、材料和方法:
　　1.對p75NTR轉(zhuǎn)基因小鼠(129sv背景)進(jìn)行基因型鑒定，通過同種基因型的小鼠交配獲得野生型(p75NTR+/+)或基因敲除型(p75NTR-/-)的純合子

9、胎鼠，分別用于后續(xù)實驗。①新生海馬神經(jīng)元存活實驗:采用18日齡的純合子胎鼠(p75NTR+/+型或p75NTR-/-型)進(jìn)行新生海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)，設(shè)定不同濃度(0，10，30，100ng/ml)的重組抗裂解proBDNF進(jìn)行干預(yù)，24h后MTT法測定特定波長下(570nm)光密度值(OD);其后觀察在一定濃度的proBDNF(30ng/ml)下給予不同濃度(0，10，30，100μg/ml)的p75NTR胞外段與人IgG Fc段融合

10、蛋白(p75/Fc，p75NTR競爭性抑制劑)20h后MTT法測定570nm處OD值，從而了解神經(jīng)元凋亡情況。②神經(jīng)元軸突生長實驗:分別采用入神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(SH-SY5Y)和原代培養(yǎng)的新生皮層神經(jīng)元(p75NTR+/+和p75NTR-/-)，給予30ng/ml的proBDNF干預(yù)，72h后通過結(jié)晶紫染色或免疫熒光染色顯示并測算兩種神經(jīng)元軸突長度;同時觀察加用30μg/ml p75/Fc后各組神經(jīng)元軸突長度變化情況。
　　2.

11、采用轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病模型小鼠(AD鼠，APPswePS1dE9，雌性，5月齡)進(jìn)行立體定位下側(cè)腦室微量注射0.1％溴酚藍(lán)（4μl），24h后取腦鑒定腦室內(nèi)擴(kuò)散情況。隨后同樣方法注射AAV-proBDNF(8×1010vg，4μl)或生理鹽水(4μl，對照)，術(shù)后4周和8周分別采用酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)檢測鼠腦內(nèi)proBDNF蛋白表達(dá)水平。
　　3.采用AD鼠(APPswePS1dE9，雌性，5月齡)，立體定位下側(cè)腦室內(nèi)注

12、射生理鹽水(NS)、AAV-proBDNF(8×1010vg)、AAV-proBDNF和小鼠源性p75NTR單克隆抗體(AAV-proBDNF8×1010vg+Anti-p75Ab0.6μg)，術(shù)后8周采用Moms水迷宮方法檢測AD鼠學(xué)習(xí)記憶功能變化。
　　4.采用ELISA法檢測AD鼠腦內(nèi)Aβ40、Aβ42并計算Aβ總水平;應(yīng)用免疫組織化學(xué)(6E10)和剛果紅(Congo red)染色方法顯示腦內(nèi)Aβ沉積和老年斑形成情況，并統(tǒng)計

13、老年斑數(shù)量。
　　二、結(jié)果:
　　1.proBDNF對新生神經(jīng)元的存活有抑制作用，且隨proBDNF的濃度升高其抑制作用增強(qiáng)，在30ng/ml時出現(xiàn)抑制效應(yīng)較為明顯(P＜0.05); proBDNF對新生神經(jīng)元存活的抑制作用隨p75/Fc濃度的升高而減弱。proBDNF(30ng/ml)能夠抑制激活后的SH-SY5Y和新生海馬神經(jīng)元的軸突生長，而p75/Fc(100μg/ml)能夠中和這種抑制效應(yīng)。proBDNF對p75NT

14、R-/-型神經(jīng)元的存活和軸突生長未顯示出明顯影響(P＞0.05）。
　　2.在采用0.1％溴酚藍(lán)進(jìn)行AD鼠側(cè)腦室定向注射24h后，取腦證實溴酚藍(lán)在腦室系統(tǒng)內(nèi)廣泛擴(kuò)散。隨后進(jìn)行側(cè)腦室注射AAV-proBDNF，ELISA檢測結(jié)果顯示，4周和8周鼠腦內(nèi)proBDNF表達(dá)水平較注射前明顯增加（4周時達(dá)高峰），顯著高于同時期假手術(shù)對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05），說明AAV-proBDNF經(jīng)側(cè)腦室注射后在8周內(nèi)腦內(nèi)proBDN

15、F均有明顯表達(dá)。
　　3.Morris水迷宮顯示，在定位巡航試驗的獲得性訓(xùn)練中三組小鼠間的巡航速度無明顯差異(P＞0.05); AAV-proBDNF組AD鼠在訓(xùn)練后其逃避潛伏期未出現(xiàn)明顯下降，在訓(xùn)練末期明顯高于假手術(shù)對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在空間探索試驗中，AAV-proBDNF組的AD鼠在目標(biāo)象限內(nèi)的時間與假手術(shù)對照組相比明顯縮短，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。而AAV-proBDNF+Anti-p7

16、5Ab組AD鼠在逃避潛伏期及在目標(biāo)象限內(nèi)時間與假手術(shù)對照組比較無明顯差異(P＞0.05)。
　　4.AAV-proBDNF組AD鼠腦內(nèi)Aβ水平高于對照組(P＜0.05）。AAV-proB DNF+Anti-p75Ab組AD鼠腦內(nèi)Aβ水平高于對照組，但低于AAV-proBDNF組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。同樣，AAV-proBDNF組AD鼠腦內(nèi)老年斑數(shù)量相對于對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05），而AAV-p