文昌魚Frizzled家族和Pygopus基因的鑒定克隆及其在早期胚胎中的表達(dá)與功能分析.pdf

1、Wnt信號通路是進化上一條十分保守的信號通路。目前，人們發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路參與后生動物體軸決定和各類器官的形態(tài)建成與發(fā)育，并且其關(guān)鍵成員在不同類群中均具有一定的同源性。盡管先前人們對Wnt信號通路及其相關(guān)基因在胚胎發(fā)育、器官形成與疾病調(diào)控中已有很多深入的研究報道，但這些數(shù)據(jù)主要來自果蠅、小鼠和人類等少數(shù)物種中，在其它物種中研究相對較少。近年來，文昌魚Wnt信號通路若干發(fā)育關(guān)鍵基因已陸續(xù)有報道并揭示出這些成員在早期胚胎發(fā)育中的功能演化，例

2、如此前報道的8個Wnt基因、β-catenin、Tcf(T cell factor)以及Dkk和Axin基因家族等。但與其它模式動物相比，文昌魚Wnt信號通路與早期胚胎發(fā)育的功能研究可以說才剛剛起步，很多發(fā)育關(guān)鍵基因的功能仍有待揭示。
　　 本文首先通過對白氏文昌魚（Branchiostoma belcheri）基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進行同源搜索分析，鑒定并克隆了Wnt信號通路Frizzled(Fz)基因家族所有4個成員以及下游細(xì)

3、胞核中Pygopus（Pygo）基因，通過進化分析、時空表達(dá)譜研究，發(fā)現(xiàn)1）文昌魚基因組中僅含有4個Fz基因，即AmphiFz1/2/7、AmphiFz4、AmphiFz5/8和AmphiFz9/10。由于之前報道佛羅里達(dá)文昌魚基因組中含有5個Fz基因，重新對以上各成員進行預(yù)測、序列比對及基因組共線性分析，澄清了文昌魚Fz基因的個數(shù)。系統(tǒng)進化樹把后口動物Fz基因家族劃分為5個亞家族，而Fz3/6亞家族成員可能是在尾索動物和脊椎動物共同祖

4、先中首次分化后產(chǎn)生的，因為它并未在文昌魚和其它除尾索動物以外的無脊椎動物類群中有發(fā)現(xiàn)。2）白氏文昌魚4個Fz基因均為母源性表達(dá)，而在檢測的10個Wnt基因中，僅AmphiWnt6、AmphiWnt1和AmphiWnt9～AmphiWnt11顯示微弱母源性表達(dá)量，提示它們可能參與了早期動植物極的建立。其次，不同Wnt基因和Fz基因啟動合子型表達(dá)的時間也并不一致，但是所有AmphiFz和AmphiWnt（AmphiWnt5～AmphiWnt

5、7除外）基因在原腸胚中期的表達(dá)量均達(dá)到最大值，這進一步提示W(wǎng)nt信號在早期胚軸建立以及原腸運動和三胚層的形成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。3）空間表達(dá)譜顯示4個AmphiFz基因在4細(xì)胞及囊胚晚期均廣泛表達(dá)。但從原腸胚中期開始，表達(dá)區(qū)域開始出現(xiàn)分化，AmphiFz1/2/7在中間背部的神經(jīng)板、體節(jié)中胚層、哈氏窩(Hatschek's pit)以及口部周圍表達(dá);AmphiFz4在神經(jīng)外胚層、中胚層、咽鰓裂內(nèi)胚層和整個腸道區(qū)域表達(dá);AmphiFz5/8

6、基因一直在最前端區(qū)域表達(dá)，而AmphiFz9/10基因在神經(jīng)板、后端體節(jié)以及尾牙部位表達(dá)。這種動態(tài)、多樣性的表達(dá)方式提示文昌魚Fz基因家族與已報道的脊椎動物多個直系同源基因類似，主要參與早期胚軸的建立、體節(jié)以及神經(jīng)系統(tǒng)和多種器官的形態(tài)建成與發(fā)育。
　　 此外，克隆獲得白氏文昌魚Wnt信號通路下游細(xì)胞核中一個Pygo基因及其在斑馬魚中兩個直系同源基因DrPygo1和DrPygo2。系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)已測序的鳥類基因組中僅含有Pygo

7、1;而在除斑馬魚以外已測序的硬骨魚基因組中僅含有Pygo2。實時表達(dá)譜揭示這3個Pygo基因均為母源性表達(dá)，且文昌魚Pygo基因合子表達(dá)區(qū)域主要集中在咽鰓裂區(qū)。原位雜交并未檢測到斑馬魚DrPygo1基因在早期胚胎中表達(dá)，相反，DrPygo2基因在早期胚胎中廣泛表達(dá)，后期表達(dá)信號則集中在神經(jīng)系統(tǒng)。利用嗎啉環(huán)（Morpholino）反義寡核苷酸敲低DrPygo2基因表達(dá)后還會導(dǎo)致斑馬魚中樞神經(jīng)系統(tǒng)和眼原基處細(xì)胞的凋亡，后腹部發(fā)育缺陷以及心臟