Cry1A類蛋白交換結(jié)構(gòu)域?qū)⑾x活性影響的研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種廣泛分布的革蘭氏陽性細(xì)菌，在形成芽胞的同時能產(chǎn)生由cry或cyt基因編碼的殺蟲晶體蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs），對多種害蟲有特異殺蟲活性。目前，Bt不僅被開發(fā)成生物農(nóng)藥在害蟲防治中得到應(yīng)用，表達(dá)Bt Cry蛋白的轉(zhuǎn)基因抗蟲植物也已經(jīng)被廣泛種植，帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益與生態(tài)效益。其中Cry1A是一個對鱗翅目害蟲有高活性的

2、殺蟲蛋白家族，目前已知的Cry1A類基因有10個模式種類，112個殺蟲基因。這些基因中cry1Ab、cry1Ac應(yīng)用最為廣泛，cry Ah基因是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所克隆的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的殺蟲基因，其編碼的Cry1Ah蛋白對棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)、亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis）和水稻二化螟(Chilo suppressalis)等多種鱗翅目害蟲具有很高的毒殺活性，超過目前商業(yè)化的cr

3、y1Ab、cry1Ac等基因，具有巨大的應(yīng)用前景，目前正在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因抗蟲植物研究。對目前已經(jīng)明確殺蟲活性蛋白的各結(jié)構(gòu)域進(jìn)行序列比對聚類發(fā)現(xiàn)，部分殺蟲活性（特別是Cry1類蛋白）可以由結(jié)構(gòu)域Ⅲ的重組獲得，Cry毒素結(jié)構(gòu)域交換是一種殺蟲特異性進(jìn)化的機(jī)制。通過序列比對發(fā)現(xiàn)，Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ah三個蛋白之間有共同的結(jié)構(gòu)域Ⅱ;Cry1Ab、Cry1Ac有共同的結(jié)構(gòu)域Ⅰ;而Cry1Ac、Cry1Ah有共同的結(jié)構(gòu)域Ⅲ。Cry1Ab

4、結(jié)構(gòu)域Ⅲ與Cry1Ac、Cry1Ah不同，但是在Cry1A家族中比較常見，與Cry1Aa、Cry1Ae、Cry1Af等蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ序列一致性大于97％;Cry1Ah結(jié)構(gòu)域Ⅰ比較獨(dú)特，不僅與Cry1Ab、Cry1Ac不同，與所有報(bào)道的Bt殺蟲蛋白的結(jié)構(gòu)域Ⅰ差異都較大。本研究通過同源建模的方法比較了Cry1Ab，Cry1Ah結(jié)構(gòu)域Ⅰ結(jié)構(gòu)、表面電荷分布特點(diǎn);進(jìn)一步構(gòu)建了編碼cry1Ah與cry1Ab、cry1Ca雜合基因;并對部分雜合基因進(jìn)行

5、了表達(dá)與功能研究，取得結(jié)果如下。
　　利用SWISS-MODEL建模分別獲得了Cry1Ah1與Cry1Ab13結(jié)構(gòu)域Ⅰ以及三個結(jié)構(gòu)域核心活性區(qū)的機(jī)構(gòu)信息，通過分子疊合比對發(fā)現(xiàn)，盡管Cry1Ah1與Cry1Ab13序列存在較大差異(31％)，但是兩者結(jié)構(gòu)域Ⅰ的碳骨架沒有差異。進(jìn)一步分析了結(jié)構(gòu)域Ⅰ的表面結(jié)構(gòu)與表面靜電勢分布，結(jié)果顯示盡管兩個蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅰ的碳骨架沒有差異，由于氨基酸序列以及氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)不同，兩個蛋白的結(jié)構(gòu)表面以及電勢分

6、布都有所不同。通無縫克隆方法，構(gòu)建了4種雜合基因;AhAhCa含有Cry1Ah結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ和Cry1Ca結(jié)構(gòu)域Ⅲ; pET-AHAHAB含有Cry1Ah結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ和Cry1Ab結(jié)構(gòu)域Ⅲ; AhAbAb含有Cry1Ah結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Cry1Ab結(jié)構(gòu)域Ⅱ、Ⅲ;PET-AHCACA含有Cry1Ah結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Cry1Ca結(jié)構(gòu)域Ⅱ、Ⅲ。成功表達(dá)了Cry1Ab、Cry1Ah的雜合蛋白pET-AHAHAB并測定了殺蟲活性，結(jié)果顯示結(jié)構(gòu)域交換引起蛋白殺蟲