BEZ235對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖及miRNA表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　肺癌是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，2012年，肺癌是全球最常診斷的癌癥，肺癌發(fā)病率約占總量的13.0％。大約85％-90％的肺癌為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，根據(jù)腫瘤細(xì)胞的大小，形狀，和組成，可將非小細(xì)胞肺癌分為三個(gè)亞型:其中腺癌占40％，鱗狀細(xì)胞癌占25％-30％，大細(xì)胞癌占10％-15％[3]。在中國(guó)，非小細(xì)胞肺癌占肺癌患者的75％-80％，其中大多數(shù)患者診斷時(shí)已在腫瘤后期階段，已不能接受手術(shù)治療，即使能夠接

2、受根治性手術(shù)治療，大多數(shù)患者由于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，多預(yù)后不良。到目前為止，藥物治療仍是晚期階段NSCLC的治療的重要方法[1、4、5]。NVP-BEZ235(BEZ235)是一種新型磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的雙重抑制劑，表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用且作用范圍廣泛，對(duì)惡性腫瘤如乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤和非小細(xì)胞肺癌有抑制作用。小分子核糖核酸(microRNA)是非編碼RNA分子，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平抑制

3、基因表達(dá)[6]。一個(gè)miRNA可以與多個(gè)不同的mRNA結(jié)合，結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)雜的增殖過(guò)程發(fā)生改變，如信號(hào)、生長(zhǎng)、分化、和轉(zhuǎn)換[7-10]。鑒于miRNA有這樣至關(guān)重要的作用，他們的表達(dá)失調(diào)在許多癌癥類(lèi)型，包括非小細(xì)胞肺癌[7]、前列腺癌、乳腺癌和胰腺癌中已被報(bào)道[9、10、12]。研究表明，在癌癥中特定的miRNA可作為強(qiáng)大的腫瘤抑制基因或致癌基因發(fā)揮作用。他們也可能作為在疾病發(fā)生和/或發(fā)展過(guò)程中的重要生物標(biāo)記物[7、8]。本實(shí)驗(yàn)就BEZ

4、235作用于肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549后，A549細(xì)胞增殖及miRNA表達(dá)的影響。
　　方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)材料
　　BEZ235購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料研究所，RPMI1640培養(yǎng)液和2.5g/L胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，二甲基亞砜(DMSO)和MTT購(gòu)白Sigma公司，A549細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。
　　二、細(xì)胞培養(yǎng)與分組
　　A549細(xì)胞用含

5、體積分?jǐn)?shù)10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液(內(nèi)含青霉素100kU/L，鏈霉素100mg/L)，置于體積分?jǐn)?shù)5％CO2、37℃恒溫孵箱中培養(yǎng)，每1～2天傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分為4組，對(duì)照組（僅含細(xì)胞和培養(yǎng)液而不含藥物），BEZ235低、中、高劑量組(分別加入2.5、5和10μmol/L BEZ235)，培養(yǎng)24、48、72h。
　　三、細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè)
　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后制

6、成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔100uL，細(xì)胞密度約為5000個(gè)/孔，置恒溫培養(yǎng)箱中孵育24h后吸出原培養(yǎng)液，按照2中分組處理，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔實(shí)驗(yàn)中止前4h，每孔加入20μL、5g/L的MTT培養(yǎng)4h后，再加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，以空白對(duì)照孔調(diào)零，在492nm波長(zhǎng)處用自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的吸光度(A)值。細(xì)胞增殖抑制率(％)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)X100％。
　　四、Hoechst33258熒

7、光染色及流式細(xì)胞儀分析
　　A549細(xì)胞(1×106)接種于6孔板，過(guò)夜時(shí)期貼壁，加入含有不同濃度BEZ235(0，2.5，5，和10μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí).PBS洗兩次、吹干、固定、PBS再洗一次，加入Hoechst33258熒光染料，熒光顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞凋亡形態(tài)并拍照，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。通過(guò)使用Annexin VFITC/PI凋亡試劑盒流式細(xì)胞術(shù)分析來(lái)確定在A(yíng)549細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率。A549細(xì)胞(1x106)接種于6孔

8、板，過(guò)夜時(shí)期貼壁，加入含有不同濃度BEZ235(0，2.5，5，和10μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。消化、收集、
　　五、miRNA表達(dá)譜的芯片分析
　　芯片合成后進(jìn)行QC質(zhì)檢，Pass之后水洗晾干，用于下一步正式雜交實(shí)驗(yàn);細(xì)胞樣品直接用Trizol法提取RNA，提取所得RNA通過(guò)紫外分光光度計(jì)、瓊脂糖凝膠電泳和Agilent2200Bioanalyzer進(jìn)行質(zhì)檢（A260/A280≥1.5，A260/A230≥1，RIN

9、 value≥7）;RNA質(zhì)檢合格后進(jìn)行分裝-80°保存;取0.5-2ug的Total RNA使用ULS標(biāo)記法標(biāo)記上cy3，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)得A260，A550，根據(jù)實(shí)驗(yàn)報(bào)告所列公式計(jì)算標(biāo)記率DOL（DOL最佳范圍是1.0-3.6）;預(yù)雜交:芯片在無(wú)菌去離子水中65℃孵育10min;換預(yù)雜交液37℃孵育1h;將Cy3標(biāo)記的RNA全部用于配置雜交液，雜交液95℃變性3min，冰上孵育20S;將芯片預(yù)雜交液吸出，換雜交液，37℃雜交16

10、h;芯片取出依次用6X SSPET，3X SSPET，0.5X SSPET，0.5X SSPET洗一遍，去除非特異性雜交背景;加顯影液及蓋玻片于雜交區(qū)域，進(jìn)行掃描;掃描后所得圖片提取數(shù)據(jù)，進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　六、miRNA的分類(lèi).
　　在微陣列上被測(cè)得的總的miRNA中，選擇153個(gè)人類(lèi)的miRNA作進(jìn)一步分析。將標(biāo)記物出現(xiàn)在至少一個(gè)樣品中的miRNA過(guò)濾并應(yīng)用于倍數(shù)變化分析。
　　七、miRNAs的靶基因預(yù)測(cè)<

11、br>　　候選miRNA是通過(guò)網(wǎng)站http://microna.sanger.ac.uk/targets/v5/篩選出來(lái)的。，人類(lèi)與血管生成、細(xì)胞凋亡、染色質(zhì)修飾、細(xì)胞分化相關(guān)的相關(guān)基因是從基因本體網(wǎng)站http://geneontology.org篩選出來(lái)的。
　　結(jié)果：
　　BEZ235能夠抑制A549細(xì)胞增殖，且呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性。不同濃度BEZ235作用于A(yíng)549細(xì)胞24h后，A549細(xì)胞的凋亡率隨BEZ235濃度的升