let-7a靶向調(diào)控NIRF基因?qū)Ψ伟〢549細(xì)胞增殖的影響及分子機制研究.pdf

1、目的:借助生物信息學(xué)手段對let-7a的靶基因進行預(yù)測和分析，以期獲得更多的有關(guān)let-7a參與的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制的信息。
　　 方法:利用miRGen數(shù)據(jù)庫，以hsa-let-7a基因為檢索詞，選擇miRanda，PicTar及TargetScanS三種計算機方法預(yù)測結(jié)果的交集，對let-7a靶基因進行預(yù)測，并通過該數(shù)據(jù)庫提供的GO（Gene Ontology）注釋信息對靶基因的生物學(xué)功能進行分析，篩選保守程度高、結(jié)合自由能低并

2、且與腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)的基因作為候選靶基因。
　　 結(jié)果經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測，我們得到了82個let-7a靶向作用的蛋白編碼基因，并篩選出8個與腫瘤增殖相關(guān)的基因作為候選靶基因，包括：NRAS、CDC34、TUSC2、NIRF、GAS7、DUSP1、RB1及PDGFB?；贜IRF（Np95/ICBP90-like RING finger）在腫瘤細(xì)胞增殖活動中的重要作用，我們著重對候選靶基因NIRF進行了分析。NIRF基因定位于9

3、p23-24.1，全長共802個氨基酸殘基，含有NIRF_N、PHD、SRA及RING四個結(jié)構(gòu)域；NIRF3’UTR（untranslation region）含有一個let-7a的結(jié)合位點，其與let-7a5'端的第1-9位堿基序列完全互補，let-7a與NIRF靶基因二聚體結(jié)構(gòu)的自由能為-16.89kcal/mol，而且該NIRF3'UTR結(jié)合位點在四個物種（包括人、小鼠、大鼠、犬）的基因組中高度保守。
　　 結(jié)論:let-

4、7a涉及的調(diào)控范圍非常廣泛，NIRF很可能是let-7a的一個靶基因。
　　 目的:通過實驗方法驗證NIRF基因是否是let-7a的直接作用靶基因。
　　 方法:構(gòu)建含有NIRF3’UTR全長的熒光素酶報告質(zhì)粒pRL-TK-NIRF3’UTR；將pRL-TK或pRL-TK-NIRF3’UTR與pGL3-control，及l(fā)et-7a mimics或control mimics共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞（let-7a表達(dá)很低），雙

5、熒光素酶報告系統(tǒng)檢測轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá)；將pRL-TK或pRL-TK-NIRF3’UTR與pGL3-control，及l(fā)et-7a inhibitor或control inhibitor共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞（表達(dá)內(nèi)源性的let-7a），雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測轉(zhuǎn)染后HeLa細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá)；分別以let-7amimics或control mimics轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，let-7a inhibitor或controlinh

6、ibitor轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，Western blot檢測NIRF蛋白表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:經(jīng)測序證實熒光素酶報告質(zhì)粒pRL-TK-NIRF3’UTR構(gòu)建成功；共轉(zhuǎn)染let-7a mimics，pRL-TK-NIRF3’UTR與pGL3-control的A549細(xì)胞組，熒光素酶活性明顯降低，為對照組（共轉(zhuǎn)染pRL-TK與pGL3-control的A549細(xì)胞組）的49.29％；共轉(zhuǎn)染let-7ainhibitor，pRL-T

7、K-NIRF3’UTR與pGL3-control的HeLa細(xì)胞組，熒光素酶活性顯著增強，比對照組（共轉(zhuǎn)染pRL-TK與pGL3-control的HeLa細(xì)胞組）增加了46.77％；Western blot檢測顯示，與未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染let-7a mimics的A549細(xì)胞中NIRF蛋白的表達(dá)顯著降低，而轉(zhuǎn)染control mimics的A549細(xì)胞中NIRF表達(dá)無明顯變化（P>0.05）；與未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染l

8、et-7a inhibitor的HeLa細(xì)胞中NIRF蛋白的表達(dá)顯著增加，而轉(zhuǎn)染controlinhibitor的HeLa細(xì)胞中NIRF表達(dá)無明顯變化（P>0.05）。
　　 結(jié)論：NIRF3’UTR含有l(wèi)et-7a的調(diào)控信息，let-7a負(fù)性調(diào)控NIRF基因的表達(dá)，NIRF是let-7a的一個靶基因。
　　 第三部分 let-7a靶向調(diào)控NIRF基因?qū)Ψ伟〢549細(xì)胞增殖的影響及分子機制研究
　　 目的:研究l

9、et-7a對A549細(xì)胞增殖的影響并探索其分子機制。
　　 方法:構(gòu)建let-7a真核表達(dá)質(zhì)粒pGenesil-let-7a，同時設(shè)計并構(gòu)建一個陰性對照質(zhì)粒pGenesil-control；構(gòu)建針對NIRF基因的特異性siRNA表達(dá)質(zhì)粒si-1、si-2、si-3及對照質(zhì)粒si-nc；將pGenesil-let-7a及pGenesil-control轉(zhuǎn)染肺癌A549細(xì)胞，G418篩選，并經(jīng)Real-timeRT-PCR檢測let

10、-7a的表達(dá)進行驗證，從而建立穩(wěn)定表達(dá)pGenesil-let-7a及pGenesil-control的A549細(xì)胞株，分別命名為A549-let-7a及A549-control細(xì)胞；采用MTT法比較A549、A549-control及A549-let-7a細(xì)胞的增殖能力并繪制生長曲線；流式細(xì)胞術(shù)分析各組細(xì)胞的細(xì)胞周期；Western blot及免疫細(xì)胞熒光檢測各組細(xì)胞中NIRF、p21WAF1及p27kip1蛋白的表達(dá)水平；NIRF基

11、因的siRNA表達(dá)質(zhì)粒si-1、si-2、si-3及si-nc分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，Western blot檢測NIRF及p21WAF1蛋白表達(dá)的變化；pIRES2-EGFP-NIRF及pIRES2-EGFP質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染A549-let-7a細(xì)胞，Western blot檢測NIRF及p21WAF1蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:經(jīng)測序證實，重組質(zhì)粒pGenesil-let-7a及pGenesil-control構(gòu)建成功，NIRF

12、基因的siRNA表達(dá)質(zhì)粒si-1、si-2、si-3及si-nc構(gòu)建成功；Real-time RT-PCR結(jié)果證實，與A549細(xì)胞相比，A549-let-7a細(xì)胞中l(wèi)et-7a的表達(dá)水平顯著增加，為A549細(xì)胞中表達(dá)量的5.34倍，而A549-control中l(wèi)et-7a的表達(dá)無明顯變化，表明成功獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，即A549-let-7a及A549-control細(xì)胞；MTT結(jié)果顯示A549-let-7a細(xì)胞較A549細(xì)胞增殖能力明顯

13、降低；流式細(xì)胞分析結(jié)果表明A549-let-7a細(xì)胞生長停滯于G1期；Western blot顯示，與A549細(xì)胞相比，A549-let-7a細(xì)胞中NIRF的表達(dá)明顯減少，p21WAF1蛋白的表達(dá)明顯增加，p27kip1蛋白的表達(dá)無明顯變化；免疫細(xì)胞熒光亦發(fā)現(xiàn)，與A549細(xì)胞相比，A549-let-7a細(xì)胞中NIRF的表達(dá)明顯減少，p21WAF1蛋白的表達(dá)明顯增加；Western blot分析A549細(xì)胞中NIRF基因的RNAi效果顯示

14、，si-1、si-2及si-3均能顯著地抑制NIRF基因的表達(dá)，其抑制率分別為70.27％，42.85％及65.49％，而各組相應(yīng)的p21WAF1蛋白表達(dá)顯著增加，與未處理的A549細(xì)胞相比，分別增加了64.21％，25.73％及34.54％；Western blot結(jié)果表明，與未處理的A549-let-7a細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-NIRF的A549-let-7a細(xì)胞中NIRF表達(dá)顯著增加，p21WAF1表達(dá)顯著降低。

15、r>　　 結(jié)論：let-7a對A549細(xì)胞的生長的抑制作用至少部分是通過靶向調(diào)控NIRF，上調(diào)p21WAF1蛋白的表達(dá)水平實現(xiàn)的。
　　 第四部分 let-7a對肺癌A549細(xì)胞祼鼠植瘤生長的抑制作用
　　 目的:研究let-7a對A549細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的影響及其可能的分子機制。
　　 方法:將A549、A549-control及A549-let-7a細(xì)胞分別接種至裸鼠背部皮下，觀察移植瘤的生長情況并計算抑

16、瘤率，30天后處死裸鼠，取出瘤體并稱重；Real-time RT-PCR檢測各組腫塊中l(wèi)et-7a的表達(dá)水平；HE染色觀察瘤組織的形態(tài)學(xué)改變；Western blot及免疫組織化學(xué)檢測各組腫塊中NIRF及p21WAF1蛋白的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果:與A549細(xì)胞注射組相比，A549-let-7a細(xì)胞注射組裸鼠的瘤組織質(zhì)量顯著降低，抑瘤率為27.51％，A549-control細(xì)胞注射組無顯著差異；Real-time RT-PCR

17、結(jié)果顯示A549-let-7a細(xì)胞注射組瘤組織中l(wèi)et-7a的表達(dá)水平較A549細(xì)胞注射組顯著增加，為A549細(xì)胞注射組的4.25倍，而A549-control細(xì)胞注射組let-7a的表達(dá)水平無明顯變化；HE染色顯示A549-let-7a細(xì)胞注射組，癌細(xì)胞較其它兩組體積減小，核漿比例明顯縮小，核分裂相顯著減少；Western blot及免疫組織化學(xué)結(jié)果均表明，與A549細(xì)胞注射組相比，A549-let-7a細(xì)胞注射組瘤組織標(biāo)本中NIRF