丹參和仙鶴草抑制A549細(xì)胞增殖及對血管生成相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、我國惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率一直呈上升趨勢，2008年全國第三次死因回顧抽樣調(diào)查結(jié)果表明，惡性腫瘤是我國居民的第二大死亡原因[1]。對于腫瘤的治療，臨床上放、化療、手術(shù)治療是主要治療手段，其中手術(shù)切除腫瘤是目前根治癌癥的主要方法，但一般僅適用于癌癥早中期及無并發(fā)癥患者，其適應(yīng)范圍有限。對于失去手術(shù)治療機(jī)會及中晚期腫瘤轉(zhuǎn)移的患者，放、化療治療十分重要，但仍存在敏感性低的問題，且對人體有較大的毒副作用。要彌補(bǔ)西醫(yī)治療存在的缺陷，輔以中藥治療

2、是切實(shí)可行的。目前國內(nèi)腫瘤臨床治療中，中藥主要用于配合放化療增效減毒、預(yù)防復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移以及缺乏有效治療手段的中晚期腫瘤抗癌治療[2]。據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，在我國每年新發(fā)生的癌癥病人超過100萬，采用手術(shù)治療的有10％-20％，有1/3的病人接受放療或化療，其余有超過半數(shù)的病人接受中醫(yī)藥治療、生物治療等其他療法。在接受中醫(yī)藥治療的病人中，大約有1/3（超過15萬）的病人通過治療減輕了痛苦，壽命得到延長[3]。大量的臨床資料表明，中醫(yī)藥在腫瘤治療中發(fā)

3、揮重要的作用，臨床應(yīng)用前景廣闊，但對中醫(yī)藥抗腫瘤作用的評價(jià)，現(xiàn)主要是憑借其臨床宏觀的用藥經(jīng)驗(yàn)，缺乏科學(xué)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來支撐，限制了中醫(yī)藥的臨床應(yīng)用和發(fā)展，因此對其進(jìn)行深入的研究將有助于更好的發(fā)揮中醫(yī)藥在腫瘤治療中的應(yīng)用，并有效的指導(dǎo)臨床用藥。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩τ谂R床常用的幾大類抗腫瘤中藥中選擇六味藥作為代表進(jìn)行抗腫瘤作用的初步研究；對理血類中藥（丹參、仙鶴草）的抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行研究；并針對理血藥對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用存在的疑問，觀察

4、活血化瘀藥丹參和收斂止血藥仙鶴草對肺腺癌A549細(xì)胞中與腫瘤血管生成相關(guān)基因VEGF、COX-2的影響，初探活血化瘀藥丹參與收斂止血藥仙鶴草是否具有影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用，以期為丹參和仙鶴草的臨床抗腫瘤應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：(1)選擇丹參、川芎、羊乳、仙鶴草、半夏、附子作為代表對人肺腺癌A549細(xì)胞進(jìn)行體外藥物篩選實(shí)驗(yàn)；(2)根據(jù)初篩結(jié)果，用丹參水提液進(jìn)行人肺癌A549細(xì)胞，人肝癌SMMC-7721細(xì)胞，人乳腺癌M

5、DA-MB-231細(xì)胞，人胃癌MGC-803細(xì)胞MTT體外篩選實(shí)驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步研究丹參水提液對A549細(xì)胞的增殖抑制作用的可能機(jī)制，包括：倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)；(3)用仙鶴草水提液對上述四株癌細(xì)胞進(jìn)行體外篩選實(shí)驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步研究仙鶴草水提液對A549細(xì)胞的增殖抑制作用的可能機(jī)制，包括：倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)；(4)采用Real-timePCR術(shù)檢測丹參、仙鶴草用藥前后對A549細(xì)胞中與腫瘤血

6、管生成相關(guān)基因COX-2、VEGF基因的表達(dá)情況。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：(1)六味藥抗A549的腫瘤篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，丹參和仙鶴草兩味藥體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用最佳；(2)丹參水提液對四株癌細(xì)胞的體外篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，丹參水提液對人肺癌A549細(xì)胞增殖抑制作用最好，呈劑量依賴性，且作用48h效果尤為顯著；倒置顯微鏡和熒光顯微鏡觀察經(jīng)丹參水提液作用48h后A549細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞皺縮，出現(xiàn)凋亡細(xì)胞；應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析技術(shù)研究表明

7、丹參水提液可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其抑制細(xì)胞增殖作用可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)；(3)仙鶴草水提液對四株癌細(xì)胞的體外篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示對人肺癌A549細(xì)胞增殖抑制作用最好，且作用48h效果尤為顯著；倒置顯微鏡可觀察到細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變；細(xì)胞熒光染色出現(xiàn)了明顯的凋亡細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、核染色質(zhì)濃縮、核碎裂等凋亡特征性的形態(tài)學(xué)改變；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示丹參水提液可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示其抑制細(xì)胞增殖作用可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)；(4)采用Real-time

8、PCR術(shù)定量檢測丹參、仙鶴草用藥前后對A549細(xì)胞COX-2、VEGF基因表達(dá)的影響，結(jié)果提示丹參水提液作用A549細(xì)胞12h后，對COX-2、VEGF基因均具有下調(diào)作用，且呈一定的劑量依賴性：仙鶴草水提液作用于A549細(xì)胞12h后，對COX-2、VEGF基因均具有下調(diào)作用，對VEGF基因的影響呈一定的劑量依賴性；對COX-2基因的下調(diào)作用最為明顯，但對COX-2基因的影響不呈現(xiàn)劑量依賴性。這提示兩味藥均可通過下調(diào)與腫瘤血管生成相關(guān)基因

9、VEGF、COX-2基因的表達(dá)，從而在一定程度上影響非小細(xì)胞肺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移，這也可能為丹參和仙鶴草水提液抑制A549細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。
　　 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示丹參、川芎、羊乳、仙鶴草、半夏、附子中丹參和仙鶴草的抗A549細(xì)胞增殖作用較好；在人肺癌A549細(xì)胞，人肝癌SMMC-7721細(xì)胞，人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，人胃癌MGC-803細(xì)胞四株細(xì)胞中，丹參和仙鶴草對A549細(xì)胞的增殖抑制作用較好，且其增殖抑制的作用機(jī)制可