BCG-PPD對(duì)γδT細(xì)胞殺傷肺癌A549細(xì)胞作用的影響.pdf

1、目的：研究卡介菌純蛋白衍生物（PurifiedProteinDerivativeofBCG,BCG-PPD）對(duì)人外周血γδT細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B表達(dá)的影響，并進(jìn)一步探討B(tài)CG-PPD對(duì)γδT細(xì)胞殺傷肺癌A549細(xì)胞的增效作用。
　　方法：
　?。?）制備γδT細(xì)胞：采用Ficoll密度梯度離心法分離健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheralbloodmononuclearcell,PBMC），以唑來膦酸(Zoledroni

2、cacid,ZA,終濃度為5nmol/ml)及白細(xì)胞介素-2（Interleukin-2,IL-2,終濃度為200IU/ml)刺激擴(kuò)增γδT細(xì)胞；
　?。?）確定最佳效靶比例：培養(yǎng)9-14天后，用流式細(xì)胞儀測(cè)定PBMC中γδT細(xì)胞的比例。按不同的效靶比例（Effector:target,E:T）將γδT細(xì)胞與肺癌A549細(xì)胞混合培養(yǎng)，48小時(shí)后用倒置顯微鏡觀察肺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，并使用乳酸脫氫酶（Lactatedehydr

3、ogenase,LDH）細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)γδT細(xì)胞對(duì)肺癌A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性，以確定最佳效靶比例。
　?。?）BCG-PPD處理后相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)：將γδT細(xì)胞與肺癌A549細(xì)胞按最佳效靶比例混合培養(yǎng)，并加入不同濃度的BCG-PPD處理，用倒置顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，48小時(shí)后使用LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)γδT細(xì)胞對(duì)肺癌A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)γδT細(xì)胞穿孔素、顆粒酶B的表達(dá)，并用透射電鏡觀察肺癌A

4、549細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。
　　結(jié)果：
　?。?）體外刺激擴(kuò)增9-14天后γδT細(xì)胞濃度從初始的（4.65±4.36）％增加到（83.82±2.18）%。
　?。?）按不同效靶比例混合培養(yǎng)γδT細(xì)胞與肺癌A549細(xì)胞時(shí)，倒置顯微鏡下可觀察到肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的差異，γδT細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用隨效靶比例的升高而增強(qiáng)，最佳效靶比為20:1。
　　（3）按20:1的效靶比例混合培養(yǎng)，并加入不同濃度的BCG-PPD處

5、理后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)加入濃度為20IU/ml的BCG-PPD處理組γδT細(xì)胞對(duì)肺癌A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性最強(qiáng)，穿孔素、顆粒酶B的表達(dá)均顯著高于未加入BCG-PPD組，倒置顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察到肺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)較未加入BCG-PPD組變化更為明顯，透射電鏡觀察到經(jīng)γδT細(xì)胞作用后肺癌A549細(xì)胞膜完整性被破壞，核膜消失，染色質(zhì)固縮、溶解。
　　結(jié)論：從健康人外周血分離出來的γδT細(xì)胞于體外刺激擴(kuò)增后，對(duì)肺癌A549細(xì)胞具有殺傷作