氧化應(yīng)激和DNA甲基化在同型半胱氨酸誘導(dǎo)神經(jīng)管畸形中的作用機制探討.pdf

1、同型半胱氨酸(homocysteine,HCY),是一種含硫氨基酸,是一碳代謝的中間產(chǎn)物。神經(jīng)管畸形(Neural Tube Defects NTDs)是指胚胎發(fā)育早期,由于遺傳因素和環(huán)境因素的影響,致神經(jīng)管的發(fā)生和分化紊亂而出現(xiàn)的人類出生缺陷中最常見和最嚴(yán)重的一組畸形。近年來的研究表明:體內(nèi)HCY升高與NTDs關(guān)系密切,但HCY致NTDs的分子機制尚不完全清楚。
　　 目的:研究HCY導(dǎo)致NTDs的新的致病機制,并針對致病機制

2、提出保護措施,為神經(jīng)管畸形的治療和預(yù)防提供基礎(chǔ)。
　　 方法:以雞胚為動物模型,研究HCY對雞胚神經(jīng)管發(fā)育的影響及可能的分子機制。通過石蠟切片和H-E染色分析HCY對雞胚神經(jīng)管的影響:檢測HCY對活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、總谷胱甘肽(GSSG)、超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)等氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響；高效液相色譜(HPLC)、全胚免疫熒光、wester blot檢測HCY對DNA甲基轉(zhuǎn)移能力的影

3、響；Taqman real timePCR檢測HCY處理后miR-124的變化；免疫組化分析SCP1.、Pax6/和Tuj1蛋白的表達；通過雞胚卵內(nèi)電轉(zhuǎn)對miR-124進行敲低和過表達,分析其對神經(jīng)管發(fā)育的影響。
　　 結(jié)果:(1)HCY能顯著降低雞胚的生存能力,影響胚胎外血管發(fā)育,導(dǎo)致脊柱裂畸形,與抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)或膽堿(CHO)聯(lián)合處理能部分恢復(fù)以上表型,表明HCY導(dǎo)致的脊柱裂與氧化應(yīng)激和一碳代謝異常有關(guān)。

4、
　　 (2)HCY導(dǎo)致ROS明顯增加,MDA含量明顯增加,Mn-SOD活性和GPX活性明顯下降,與NAC聯(lián)合處理能部分恢復(fù)以上改變。
　　 (3)HCY導(dǎo)致基因組DNA整體低甲基化,S-腺苷甲硫氨酸(SAM)含量下降,S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)含量上升,SAM/SAH下降,DNMT1和DNMT3a蛋白表達下降,CHO與HCY聯(lián)合處理能部分恢復(fù)以上改變。
　　 (4)NAC與HCY聯(lián)合處理能部分恢復(fù)HCY導(dǎo)致

5、的基因組整體低甲基化和DNMT1及DNMT3a蛋白表達的下降,SAM、SAH及SAM/SAH則沒有明顯差別。
　　 (5)HCY導(dǎo)致miR-124表達明顯下調(diào),與去甲基化藥物5-氮雜脫氧胞苷(5-AZA)聯(lián)合處理能部分恢復(fù)表達,表明miR-124的調(diào)控與啟動子區(qū)超甲基化有關(guān)。免疫組化顯示miR-124調(diào)控的靶基因SCP1表達上調(diào),神經(jīng)前體細(xì)胞marker Pax6表達上調(diào),神經(jīng)元marker Tui1表達下調(diào)。
　　 (

6、6)對miR-124進行敲低后雞胚出現(xiàn)脊柱裂,SCP1和Pax6表達上調(diào),Tuj1表達下調(diào),表明miR-124在神經(jīng)管正常發(fā)育中起著重要作用。
　　 結(jié)論:(1)本研究首次證實HCY可通過氧化應(yīng)激影響DNA甲基轉(zhuǎn)移能力,并證實NAC和CHO對HCY導(dǎo)致的NTDs具有保護作用。
　　 (2)HCY通過氧化應(yīng)激和干擾甲基代謝影響DNA甲基轉(zhuǎn)移能力,導(dǎo)致基因組DNA整體低甲基化,并伴隨局部區(qū)域的超甲基化。這種表觀遺傳修飾可能是