基于DNA甲基化途徑同型半胱氨酸對大鼠神干細(xì)胞增殖作用機制的研究.pdf

1、目的
　　研究同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)對體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞(neural stemcells，NSCs)增殖作用的影響，以及通過建立大腦中動脈栓塞(middle cerebralartrty occlusion，MCAO)模型，觀察Hcy對局灶性腦缺血損傷大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖的作用，探討Hcy基于DNA甲基化途徑調(diào)控NSCs增殖的作用機制。
　　方法
　　采用無血清培養(yǎng)原代培養(yǎng)新生大鼠NSCs，將

2、細(xì)胞隨機分成4組:正常對照組（培養(yǎng)液中添加Hcy0μmol/l，Hcy-C組）、Hcy低劑量組（培養(yǎng)液中添加Hcy30μmol/l，Hcy-L組）、Hcy中劑量組（培養(yǎng)液中添加Hcy300μmol/l，Hcy-M組）、Hcy高劑量組（培養(yǎng)液中添加Hcy1 mmol/l，Hcy-H組，）。采用Cell Dimension軟件對神經(jīng)球直徑進行測量;采用免疫熒光(Immunofluorescent, IF)檢測NSCs標(biāo)記物Brdu和Sox2

3、的表達;采用乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)測定試劑盒檢測不同濃度Hcy作用下培養(yǎng)液中LDH的活力;采用DNA甲基化定量試劑盒檢測不同Hcy濃度下細(xì)胞總甲基化水平;采用甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測試劑盒檢測DNMTs總活性以及Western Blot檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferases，DNMTs)的蛋白表達;采用高效液相法(HPLC)檢測細(xì)胞內(nèi)S-腺苷甲硫氨酸(s-adenosylme

4、thionine，SAM)、S-腺苷同型半胱氨酸(s-adenosylhomocysteine，SAH)的水平。
　　成年雄性SD(sprague-nawley)大鼠隨機分假手術(shù)組(sham operation group，SO組)、大腦中動脈栓塞模型(middle cerebral artery occlusion group，MCAO組)以及大腦中動脈栓塞模型+同型半胱氨酸(middle cerebral artery occ

5、lusion+Hcygroup, MCAO+Hcy組)3組。SO組和MCAO組腹腔注射生理鹽水5 ml/kg·bw·d，MCAO+Hcy組腹腔注射2％ Hcy溶液5 ml/kg·bw·d，注射28 d。通過Morris水迷宮實驗檢測大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力;采用免疫組化法以及Western blot檢測Sox2蛋白的表達;采用DNA甲基化定量試劑盒檢測總甲基化水平;采用甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測試劑盒檢測DNMTs總活性;采用Western Bl

6、ot檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的蛋白表達。采用高效液相法(HPLC)檢測大鼠血漿內(nèi)Hcy、SAM、SAH的水平。
　　結(jié)果
　　用無血清培養(yǎng)原代培養(yǎng)新生大鼠NSCs6 d后，細(xì)胞聚集成球形團塊，呈懸浮狀態(tài)，Hcy添加組細(xì)胞神經(jīng)球直徑較對照組小，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Brdu和Sox2經(jīng)免疫熒光雙標(biāo)記法鑒定均呈雙陽性表達，Hcy添加組Brdu/Sox2雙標(biāo)陽性率較對照組小，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。經(jīng)LD

7、H測定試劑盒檢測，Hcy添加組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性較對照組升高，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。DNA總甲基化水平檢測結(jié)果顯示:與對照組相比，Hcy添加組細(xì)胞總甲基化水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。DNMTs總活性檢測結(jié)果顯示:與對照組相比，Hcy添加組較對照組DNMTs總活性均下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Western Blot結(jié)果顯示，與對照組相比，Hcy添加組DNMT1蛋白表達均下降，差異均有統(tǒng)

8、計學(xué)意義（P＜0.05），Hcy-H組較Hcy-L組和Hcy-M組DNMT1蛋白表達下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）;與對照組和Hcy-L組相比，Hcy-M組和Hcy-H組DNMT3a蛋白表達均下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;與對照組和Hcy-L組相比，Hcy-M組和Hcy-H組DNMT3b蛋白表達均下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。HPLC檢測結(jié)果顯示:與對照組和Hcy-L組相比，Hcy-M組和Hcy-H組S

9、AH的水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;與對照組和Hcy-L組相比，Hcy-M組和Hcy-H組SAM/SAH比值降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　腹腔注射及造模成功后Morris水迷宮實驗顯示，與MCAO組相比，MCAO+Hcy組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與MCAO組相比，及MCAO+Hcy組單位時間內(nèi)穿越平臺區(qū)域次數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。DNA總

10、甲基化水平檢測結(jié)果顯示:與MCAO組相比，MCAO+Hcy組總甲基化水平下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。經(jīng)免疫組化及Western blot檢測:與MCAO組相比，MCAO+Hcy組Sox2蛋白表達降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。DNMTs總活性檢測結(jié)果顯示:與MCAO組相比，MCAO+Hcy組Sox2蛋白表達降低DNMTs活性下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Western blot結(jié)果顯示:與MCAO組相

11、比，MCAO+Hcy組DNMT1、DNMT3a蛋白表達降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)HPLC檢測顯示，與SO組及MCAO組相比，MCAO+Hcy組Hcy濃度下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;與SO組及MCAO組相比，MCAO+Hcy組SAM/SAH比值下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。免疫熒光染色結(jié)果顯示，Sox2呈陽性表達，且MCAO+Hcy組表達較SO組及MCAO組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05