高糖、高同型半胱氨酸誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制探討.pdf

1、目的：觀察高同型半胱氨酸（Hcy）與高糖單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用對(duì)小鼠足細(xì)胞凋亡及其PKC活性、podocinmRNA表達(dá)的影響，探討高糖、高同型半胱氨酸對(duì)足細(xì)胞損傷的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.將小鼠足細(xì)胞孵育于含50U/mLγ-干擾素，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，10％(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，33℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入不含γ-干擾素的10%胎牛血清1640培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)箱中

2、誘導(dǎo)分化10～14d，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　2.將分化成熟的足細(xì)胞于不含胎牛血清的1640培養(yǎng)液中同步培養(yǎng)24h，隨機(jī)分為①對(duì)照組：正常對(duì)照組（5mmol/L葡萄糖）、高滲對(duì)照組（5mmol/L葡萄糖+20mmol/L甘露醇）；②損傷組：高Hcy組（1mmol/L的Hcy）、高糖組（25mmol/L葡萄糖）、混合組（1mmol/L的Hcy+25mmol/L葡萄糖）；③PKC抑制劑組：高Hcy+白屈菜紅堿（10-5mmol

3、/L）、高糖+白屈菜紅堿（10-5mmol/L）、高Hcy+高糖+白屈菜紅堿（10-5mmol/L）；各組細(xì)胞繼續(xù)孵育24、48、72h，通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)；分別收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，ELISA法檢測(cè)各組PKC活性，RT-PCR法檢測(cè)podocinmRNA表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.正常組與高滲組相比，凋亡率、PKC活性及podocinmRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞孵育24h時(shí)，各組細(xì)胞未見到明

4、顯的細(xì)胞凋亡，凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；48h時(shí)，高Hcy、高糖、混合組細(xì)胞凋亡率分別為（13.42±1.35）%、（12.98±1.02）%、（20.72±0.36）%，較正常組升高（P<0.05），混合組細(xì)胞凋亡更加明顯（P<0.01）；72h時(shí)，上述3組細(xì)胞凋亡較48h更加明顯（P<0.05），凋亡率分別為（20.27±1.80）%、（21.49±1.20）%、（27.77±1.81）%；高Hcy組、高糖組和混合組細(xì)

5、胞孵育24h時(shí)，PKC活性較正常組升高（P<0.05），PodocinmRNA表達(dá)相比正常對(duì)照組降低（P<0.05），混合組更為明顯（P<0.01），隨著時(shí)間推移，48、72h時(shí)，上述差異更為明顯（P<0.05）。
　　2.抑制劑組細(xì)胞孵育24h時(shí)，各組細(xì)胞凋亡率較對(duì)應(yīng)的損傷組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），48h時(shí)，高Hcy、高糖、混合組細(xì)胞凋亡率分別為（10.10±1.57）%、（10.33±1.98）%、（16.99±2

6、.44）%，較對(duì)應(yīng)的損傷組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），72h仍有上述差異；24h時(shí)，podocinmRNA表達(dá)較對(duì)應(yīng)的損傷組增高（P<0.05），72h仍有上述差異。
　　結(jié)論：
　　1.高Hcy和高糖均可誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞凋亡，且具有一定的時(shí)效性，二者共同作用較單獨(dú)作用時(shí)更強(qiáng)，高Hcy可加重高糖對(duì)足細(xì)胞的促凋亡作用；
　　2.高Hcy和高糖可下調(diào)podocinmRNA的表達(dá)，且二者具有疊加效應(yīng)，作用呈時(shí)間依賴