油酸致A549細(xì)胞損傷模型建立及其對(duì)Sp-B影響研究.pdf

1、目的:
　　大量研究顯示油酸(oleic acid，OA)所致急性肺損傷（acute lung injury，ALI）動(dòng)物模型的病理學(xué)變化與與臨床極為相似，但其致傷機(jī)制尚不太明確，且國(guó)內(nèi)外關(guān)于OA致傷的體外模型層面研究較少。我們嘗試建立OA刺激致肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞株A549細(xì)胞損傷的體外模型，并探討不同濃度OA損傷對(duì)A549細(xì)胞SP-B的影響。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)分組:A549細(xì)胞培養(yǎng)至3代后，融合率＞80％。(1

2、)對(duì)照組:不加入OA，替代以實(shí)驗(yàn)組等量的DMEM（不含胎牛血清），37℃孵箱培養(yǎng)24h;(2) OA組:按照OA終濃度分別分為300umol/L、400 umol/L、500 umol/L及600 umol/L4個(gè)亞組，37℃孵箱培養(yǎng)24h; LPS組:(1)對(duì)照組:同OA對(duì)照組;(2)實(shí)驗(yàn)組:按照0.1 ug/ml、1 ug/ml、10ug/ml及100ug/ml的LPS濃度分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，37℃孵箱培養(yǎng)24h;
　　2.光鏡觀

3、察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性:細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)符合實(shí)驗(yàn)要求后，按實(shí)驗(yàn)分組濃度刺激。先用倒置顯微鏡，200倍鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并拍照。加入CCK-8，采用GEN5軟件及酶標(biāo)儀，進(jìn)行OD值檢測(cè)。
　　3.ELISA檢測(cè)SP-B表達(dá):各組細(xì)胞按4×104個(gè)/ml接種于96孔孔板中，5個(gè)復(fù)孔每組，共需接5組。每孔上清液于24h后收集，按ELISA試劑盒操作說(shuō)明書對(duì)收集的上清液進(jìn)行SP-B表達(dá)檢測(cè)分析。
　　4.West

4、ern Blot檢測(cè)SP-B分泌:細(xì)胞傳至3代以后，對(duì)上清液及細(xì)胞進(jìn)行程序化處理，按照Western Blot檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書對(duì)收集的SP-B分泌及表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件采用SPSS16.0，有效數(shù)字保留小數(shù)點(diǎn)后2位，計(jì)量資料采用x±s形式表達(dá)，計(jì)量資料采用單因素方差分析。當(dāng)P值小于0.05時(shí)，我們認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化:OA對(duì)照組A549細(xì)胞胞質(zhì)豐富

5、、呈多角形，細(xì)胞突起明顯，貼壁性生長(zhǎng)，融合成片，無(wú)核固縮;300umol/L組，細(xì)胞胞體輕微變圓，體積略微縮小，突起逐漸減少，少量大小不均的顆粒開始出現(xiàn)于胞質(zhì)內(nèi);400 umol/L組，細(xì)胞胞體比較明顯的變圓，體積變小，有較多的突起變少，比較多大小不均的顆粒開始出現(xiàn)于胞質(zhì)內(nèi);500 umol/L及600 umol/L組，細(xì)胞器開始崩解，碎裂，基本無(wú)完整的細(xì)胞胞體，皺縮的細(xì)胞核開始大量出現(xiàn)。LPS各組隨LPS濃度增加與OA組形態(tài)學(xué)變化一致

6、。
　　2.CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性:CCK-8檢測(cè)檢測(cè)顯示300、400、500和600μmol/LOA組OD值呈劑量依賴性下降，分別為空白對(duì)照組的87.0％、75.7％、64.4％和56.8％(P＜0.05)。CCK-8檢測(cè)檢測(cè)顯示0.1 ug/ml、1ug/ml、10ug/ml及100ug/mlLPS組OD值呈劑量依賴性下降，分別為空白對(duì)照組的86.7％、75.4％、48.9％和44.0％(P＜0.05)。
　　3.

7、ELISA檢測(cè)上清液中SP-B表達(dá):ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SP-B表達(dá)量隨300、400、500和600μmol/LOA組呈劑量依賴性上升，分別為空白對(duì)照組的145.5％、187.4％、223.9％和235.3％(P＜0.05)，且符合S曲線分布(R=1.00)。除600μμmol/LOA組外，各組組間兩兩t檢驗(yàn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SP-B表達(dá)量隨0.1 ug/ml、1ug/ml、10ug/ml及1

8、00ug/ml LPS組呈劑量依賴性上升，分別為空白對(duì)照組的102.7％、124.2％、152.5％和157.2％(P＜0.05)。部分組間兩兩t檢驗(yàn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.Western Blot檢測(cè)SP-B分泌Western Blot檢測(cè)表明43KD SP-B表達(dá)量隨OA和LPS濃度升高逐步降低，43KD為完整Pro SP-B片段。
　　結(jié)論:
　　在模擬ALI實(shí)驗(yàn)中，隨著細(xì)胞逐步破壞，S