麥冬皂苷B通過miR-34b-5p對非小細胞肺癌A549細胞影響的研究.pdf

1、研究的目的和意義:
　　肺癌嚴重危害人類健康是目前世界上最常見的惡性腫瘤，在惡性腫瘤所致的死亡中居首位，造成極大的疾病負擔(dān)。其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的主要病理類型，占所有肺癌病例的80％以上。隨著綜合治療模式以及分子生物化學(xué)的發(fā)展，NSCLC的療效有所提高，但預(yù)后仍不理想，5年總生存率不到20％。微小核糖核酸(miRNA)是一類廣泛存在的非編碼蛋白的小分子RNA，m

2、iRNA表達及調(diào)控失衡在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。近年來，隨著對microRNA研究的深入，越來越多的研究顯示miRNA在肺癌的發(fā)展過程中占有重要的地位。其中miR-34b-5p被證實與NSCLC的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。
　　目前中醫(yī)藥在臨床上治療腫瘤已取得顯著療效，相比于西醫(yī)治療腫瘤，中醫(yī)在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和遷移，防止腫瘤復(fù)發(fā)，穩(wěn)定瘤體，改善患者全身癥狀，提高患者生活質(zhì)量等方面具有明顯優(yōu)勢?！爸苁峡私饚r方”是國醫(yī)大師周仲瑛教

3、授通過長期臨床實踐總結(jié)由養(yǎng)陰益氣、活血祛瘀、燥濕化痰、軟堅散結(jié)等四類功效藥物組成的治療肺癌的有效方劑。經(jīng)高通量篩選，得到對非小細胞肺癌(NSCLC)有細胞毒作用的單體靶點有20余種，包括麥冬皂苷、異甘草素、槲皮素、人參皂苷和聯(lián)芐類化合物等單體化合物。在這張抗肺癌方劑中，麥冬皂苷B(Ophiopogonin B，OP-B)作為一味不可或缺的中藥組分，具有顯著的體外抗癌作用，但其相關(guān)機理有待進一步研究。本實驗通過檢測感染過表達慢病毒LV-h

4、sa-miR-34b的A549細胞以及加入了OP-B的A549細胞中miR-34b-5p及Met的表達，來揭示OP-B抗NSCLC的可能機制。
　　方法:
　　通過閱讀相關(guān)文獻，挑選出數(shù)個對非小細胞肺癌A549細胞有影響的miRNA，通過Real-time PCR技術(shù)從中篩選出加入麥冬皂苷B后差異表達的miRNA，以此miRNA為靶點，通過Real-time PCR技術(shù)比較其在正常胚胎肺成纖維細胞MRC-5細胞以及A549細

5、胞中的表達量，鑒定其在非小細胞肺癌A549的表達特性，判斷其發(fā)揮的作用。構(gòu)建hsa-miR-34b過表達慢病毒載體，用重組質(zhì)粒pHLV-miR-34b感染A549細胞并鑒定轉(zhuǎn)染效率。通過常用的TargetScans、PicTar和PITA等靶基因預(yù)測軟件預(yù)測miR-34b的潛在靶基因。通過Real-time PCR以及Western Blot技術(shù)從基因水平以及蛋白水平驗證miR-34b-5p和OP-B對Met的影響，通過劃痕實驗和tra

6、nswell實驗驗證miR-34b-5p對A549細胞遷移和侵襲的影響，以期揭示OP-B可能的抗癌機制。
　　結(jié)果:
　　1.Real-time PCR結(jié)果顯示加入藥物前后miR-21-5p、miR-148a-3p、miR-29a-3p、miR-338-5p、miR-125a-5p的表達變化不明顯，而miR-34b-5p的表達變化顯著，明顯升高，說明麥冬皂苷B能影響A549細胞中miR-34b-5p的表達。
　　2.R

7、eal-time PCR顯示正常胚胎肺成纖維細胞MRC-5細胞中miR-34b-5p的表達量明顯高于非小細胞肺癌A549細胞，說明miR-34b-5p在非小細胞肺癌中發(fā)揮抑癌的作用。
　　3.hsa-miR-34b過表達慢病毒載體的構(gòu)建及效率鑒定的實驗，通過基因測序顯示miR-34b的基因正確地插入到了載體pHLV中，Real-time PCR顯示轉(zhuǎn)染后的細胞miR-34b-5p的表達量明顯升高，熒光鏡下可見發(fā)光蛋白，說明重組慢病

8、毒質(zhì)粒成功感染A549細胞。
　　4.通過查閱相關(guān)文獻并利用生物學(xué)靶基因預(yù)測軟件分析，發(fā)現(xiàn)miR-34b預(yù)測的靶基因中包括met，且提示met可能是miR-34b-5p的關(guān)鍵下游靶基因。
　　5.Real-time PCR以及Westem Blot結(jié)果示Micro-up組和OP-B組細胞Met的表達低，而A549組和NC組Met的表達高。
　　6.劃痕實驗和transwell實驗結(jié)果顯示Micro-up組細胞遷移和侵襲

9、慢，而NC組細胞遷移和侵襲快。
　　結(jié)論:
　　1.麥冬皂苷B能顯著降低非小細胞肺癌A549細胞中miR-34b-5p的表達水平。
　　2.miR-34b-5p在非小細胞肺癌A549細胞中表達下調(diào)，發(fā)揮抗癌作用。
　　3.met是miR-34b-5p的靶標基因。
　　4.外源性上調(diào)miR-34b-5p的表達，可在基因和蛋白水平下調(diào)Met的表達;加入麥冬皂苷B，也可在基因和蛋白水平下調(diào)Met的表達。麥冬皂苷B