酪氨酸激酶C-Src在機(jī)械通氣肺損傷中的作用機(jī)制.pdf

1、目的:
　　機(jī)械通氣相關(guān)肺損傷（Ventilation induced-lung injury，VILI）是指在利用呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣時(shí)，由于機(jī)械通氣的原因和肺部原發(fā)病交叉引起的急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)。機(jī)械因素通過(guò)破壞肺泡細(xì)胞膜的完整性，影響細(xì)胞膜的通透性，引起肺泡水腫，進(jìn)而引起肺損傷。致密連接蛋白(Tightjunctions，TJs) Occludin是維持肺泡上皮通透性和屏障功能的重要連接蛋

2、白。因此，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)（周期性機(jī)械牽張小鼠肺泡上皮細(xì)胞）和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)（不同潮氣量機(jī)械通氣）來(lái)模擬機(jī)械通氣相關(guān)肺損傷，觀察致密連接蛋白Occludin和酪氨酸激酶c-Src的表達(dá);使用c-Src激酶抑制劑后，Occludin蛋白表達(dá)的變化及c-Src激酶磷酸化狀態(tài)，及c-Src激酶在VILI中的作用機(jī)制。
　　方法:
　　體外實(shí)驗(yàn):將單層培養(yǎng)的小鼠肺泡上皮細(xì)胞（MEL-12細(xì)胞）隨機(jī)分為5組，對(duì)照組（C組）、機(jī)械牽張組（S

3、組）、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)組（D組）、酪氨酸激酶(c-Src)抑制劑(PP2)組（P組）、小分子RNA干擾（siRNA-Occludin）組（Si組）。D組、P組在進(jìn)行周期性機(jī)械牽張前30min用c-Src激酶抑制劑PP2(100umol/L)和DMSO(30ul/ml)進(jìn)行預(yù)處理。C組未進(jìn)行周期性機(jī)械牽張;S組以頻率0.5HZ，牽張幅度為8％、20％分別進(jìn)行周期性機(jī)械牽張MLE-12細(xì)胞，D組、

4、P組以頻率0.5HZ，牽張幅度20％進(jìn)行周期性機(jī)械牽張預(yù)處理后的MLE-12細(xì)胞，S組的牽張時(shí)間時(shí)間為1h、2h、4h，D組、P組的機(jī)械牽張時(shí)間為4h。Si組進(jìn)行siRNA-Occludin預(yù)處理。預(yù)處理及周期性機(jī)械牽張后，一部分在冰上迅速進(jìn)行蛋白裂解，提取總蛋白，用于Western Blotting檢測(cè)Occludin蛋白及c-Src激酶的表達(dá);另一部分，用4％多聚甲醛固定10min，透膜封閉后，采用細(xì)胞免疫熒光觀察Occludin蛋

5、白的分布。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn):30只健康Wistar大鼠，體重250-300g，隨機(jī)分為5組，每組6只:對(duì)照組（C組），小潮氣量組（M組），大潮氣量組（H組），小潮氣量+c-Src激酶抑制劑組（M+P組），大潮氣量+c-Src激酶抑制劑組（H+P組）。C組大鼠不進(jìn)行機(jī)械通氣;M組、H組、M+P組、H+P組均進(jìn)行機(jī)械通氣，呼吸頻率均為40次/min，吸呼比(I∶E)為1∶2，吸入氧濃度為21％，通氣時(shí)間為4h。M組和M+P組潮氣量為7m

6、L/kg;H組和H+P組潮氣量為42mL/kg。M+P組和H+P組在麻醉前用c-Src激酶抑制劑PP2(1ug/kg)預(yù)處理1h。機(jī)械通氣后，記錄肺損傷評(píng)分;右肺上葉迅速放入液氮中，凍存?zhèn)鋀estern Blotting測(cè)Occludin蛋白及c-Src激酶;右肺其他部分固定于4％多聚甲醛中，做HE染色;左肺用來(lái)測(cè)干濕重比評(píng)價(jià)肺水腫(W/D)。
　　結(jié)果:
　　體外實(shí)驗(yàn):
　　1.免疫熒光發(fā)現(xiàn)，牽張幅度20％的周期性機(jī)

7、械牽張，Occludin表達(dá)呈時(shí)間依賴性，隨牽張時(shí)間的增長(zhǎng)，Occludin表達(dá)減少，PP2預(yù)處理后，進(jìn)行機(jī)械牽張，Occludin表達(dá)較未用PP2預(yù)處理多。
　　2.Western Blotting發(fā)現(xiàn)，S組中牽張幅度為8％的周期性機(jī)械牽張1h、2h、4h，與牽張0h相比，Occludin表達(dá)沒(méi)有明顯變化（P＞0.05）;S組中振幅為20％的周期性機(jī)械牽張1h、2h、4h，與牽張0h相比，c-Src激酶表達(dá)明顯升高（P＜0.05

8、），Occludin表達(dá)明顯降低（P＜0.05）;與S組中機(jī)械牽張4h比較，D組中機(jī)械牽張4h的Occludin沒(méi)有明顯改變（P＞0.05）;與S組中機(jī)械牽張4h比較，P組中機(jī)械牽張4h，Occludin表達(dá)升高（P＜0.05）。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn):
　　1.HE染色發(fā)現(xiàn)，大潮氣量機(jī)械通氣肺泡充血嚴(yán)重，出血，肺泡壁增厚，肺透明膜形成;加入PP2后進(jìn)行大潮氣量機(jī)械通氣后，肺泡充血及出血減少，肺泡壁增厚減少;小潮氣量機(jī)械通氣肺泡變化

9、不明顯;
　　2.Western Blotting發(fā)現(xiàn)，與C組及M組比較，H組Occludin蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）,總的和磷酸化的c-Src激酶表達(dá)均升高（P＜0.05）;與H組比較，H+P組Occludin蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），總的和磷酸化的c-Src激酶表達(dá)均降低（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　大潮氣量機(jī)械通氣導(dǎo)致機(jī)械通氣肺損傷，可能與酪氨酸激酶c-Src有關(guān)。c-Src激酶磷酸化導(dǎo)致c-Src