細胞融合與單克隆抗體

1、細胞融合技術,化學與生命科學學院,第十四章,細胞融合（cell fusion）：是指兩個或更多個不同細胞在助融劑的作用下，通過膜融合形成具有新遺傳特性的雜種細胞的技術。,按照技術過程的不同，細胞融合可以分為： 細胞融合；原生質(zhì)體融合；細胞拆合,顯微鏡下細胞融合過程,融合過程中兩個細胞膜從彼此接觸到破裂形成細胞橋的變化過程圖解,幾種細胞融合成功的例子,植物細胞融合過程,人造小鼠培育過程示意圖,細胞融合的意義,理論上說任何細胞，都有可能

2、通過體細胞雜交而成為新的生物資源。這對于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠的意義。融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機制的限制，為遠緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。,體細胞雜交產(chǎn)生的雜種細胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。淋巴細胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。,第一節(jié) 動物細胞融合技術,一. 免疫學知識 人體和動物都有免疫系統(tǒng)，包括非特

3、異性免疫和特異性免疫。非特異性免疫主要有宿主的屏障，吞噬細胞，抗菌物質(zhì)，以及炎癥反應。 特異性免疫又分為細胞免疫和體液免疫。,概 述,細胞免疫 主要是指機體受到異己物質(zhì)（抗原）的刺激后，一類小淋巴細胞——依賴胸腺的T細胞發(fā)生增生，分化，直接攻擊靶細胞或間接地釋放一些淋巴因子從而使機體達到免疫的過程。,體液免疫 是當機體受到抗原刺激后，來源于骨髓的小淋巴細胞——B淋巴細胞進行增生和分化為漿細胞，進而合成各種

4、免疫球蛋白(抗體)，然后在體液中發(fā)揮免疫作用的過程。,體內(nèi)的B淋巴細胞可以被外來的抗原所激活并產(chǎn)生相應單一、均勻的特異性抗體，但在體外無法進行繁殖和傳代；（短命） 骨髓瘤細胞在體外具有很強的繁殖能力；（長命） 將二者進行細胞融合，制成雜交瘤細胞，就可以在體外持續(xù)分泌出成分單一的特異抗體，即單克隆抗體。,二. B淋巴細胞與骨髓瘤細胞的特性,不分泌抗體長命,分泌抗體短命,分泌抗體長命,細胞融合技術：,1984年Nobel醫(yī)

5、學獎,單克隆抗體,單克隆抗體是將能產(chǎn)生抗體的細胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細胞系，而產(chǎn)生的抗體。 由于這種抗體是針對一個抗原決定簇的抗體，又是由單一的B淋巴細胞克隆產(chǎn)生的，所以稱為單克隆抗體。,特定目標抗原,能分泌針對于該抗原的特異性抗體,一、淋巴細胞的制備,1. 常用的免疫動物Balb/c小鼠。 免疫方法 常規(guī)免疫法 “穩(wěn)妥；優(yōu)勢克隆” 脾內(nèi)一

6、次性免疫法 “省時；省抗原” 短程免疫法 “省時” 體外免疫法 “操作繁瑣” 常規(guī)免疫法的免疫途徑 皮下注射 腹腔注射 靜脈注射,2. 常規(guī)免疫法免疫程序：,采集脾臟細胞,二、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng),1. 細胞融合 脾細胞懸液的制備：最后一次免疫后第3天制備 骨髓瘤細胞懸液的制備：于對數(shù)生長期制備 聚乙二醇（PEG）細胞融合：濃度40-50% 分子量4000,

7、 pH8.0, 38℃, 1min,融合方法: 取適量脾細胞（1×108）與骨髓瘤細胞(2×107）進行混合，在聚乙二醇（PEG）作用下誘導它們?nèi)诤?，時間控制在1分鐘以內(nèi)，然后用培養(yǎng)液將聚乙二醇融合液緩緩稀釋。,2. 雜交瘤細胞的篩選：,H：次黃嘌呤; A：氨基喋呤; T：胸腺嘧啶,A,(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase) 次嘌呤鳥嘌呤磷酸核

8、糖轉(zhuǎn)移酶 ( HGPRT ),胸腺嘧啶激酶 ( TK )(Thymidine kinase),B淋巴細胞：HGPRT+，TK+,骨髓瘤細胞：HGPRT-，TK-,存活,死亡,外源性途徑(旁路途徑),,,3.HAT培養(yǎng)基篩選原理,4. HAT培養(yǎng)基的篩選,2 weeks later,1 week later,（每2-3天換液1/2換液）,,,,,,,,,細胞培養(yǎng)瓶,,,細胞培養(yǎng)瓶,,細胞培養(yǎng)板,,細胞培養(yǎng)皿,要求： 簡便、快速、敏感;

9、,酶聯(lián)免疫吸附法 (enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)間接免疫熒光法 (Indirect immunofluorescence, IFA)放射免疫法 (radio immuno assay, RIA),三、 抗體的檢測,常用方法：,待檢雜交瘤培養(yǎng)上清液,技術原理,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),有限稀釋法軟瓊脂平板法顯微操作法,ELISA法檢測單克隆雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清，選出分泌特

10、異性抗體的陽性孔，所分泌抗體即為單克隆抗體。,四、克隆化,常用克隆化方法：,動物接種法 將穩(wěn)定分泌單抗的細胞株，通過擴大培養(yǎng)，接種于Balb/c小鼠腹腔內(nèi)，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔內(nèi)增殖，從而得到大量含單抗的腹水。 大規(guī)模細胞培養(yǎng)法 利用微載體、微囊、旋轉(zhuǎn)瓶、中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)等進行大規(guī)模培養(yǎng)。,五、大規(guī)模培養(yǎng)——批量生產(chǎn)單克隆抗體,常用的大規(guī)模培養(yǎng)方法：,,雜交瘤技術操作流程圖解,,,,,,,,,,,,,第二節(jié) 原生質(zhì)

11、體融合技術,一、仙臺病毒法,仙臺病毒誘導細胞融合經(jīng)四個階段：①兩種細胞在一起培養(yǎng)，加入病毒，在4℃條件下病毒附著在細胞 膜上。并使兩細胞相互凝聚；②在37℃中，病毒與細胞膜發(fā)生反應，細胞膜受到破環(huán)，此時需 要Ca2+和Mg2+，最適PH為8.0一8.2；②細胞膜連接部穿通，周邊連接部修復，此時需Ca2+和ATP；④融合成巨大細胞，仍需ATP 。,病毒促使細胞融合的主要步驟如下：,兩個原生質(zhì)體或細胞在病

12、毒黏結作用下彼此靠近；通過病毒與原生質(zhì)體或細胞膜的作用使兩個細胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相滲透；兩個原生質(zhì)體的細胞核互相融合，兩個細胞融為一體；進入正常的細胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種細胞。,用滅活的病毒誘導的動物細胞融合過程示意圖,優(yōu)點是易得，用法簡單，融合效果穩(wěn)定。聚乙二醇(PEG)結構為：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于 200小于6000者均可用作細胞融合劑。PEG濃度以W/W；如將1

13、0克PEG與10mlEagLe氏液混合（假定1ml 培養(yǎng)液為1g重)，即成50％PEG溶液。PEG經(jīng)高壓滅菌后，與溫熱的Engle氏液混合。通常用分子量低于1000的PEG作融合劑最好，50％PEG溶液能產(chǎn)生 最多雜交細胞。PEG溶液在pH6.0時細胞融合率最高。,二、聚乙二醇（PEG）法,聚乙二醇（PEG）法細胞融合過程,PEG的作用機理： Kao等認為，由于PEG分子具有輕微的負極性，故可以與具有正極性基團的水

14、、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，從而在在質(zhì)膜之間形成分子橋，其結果是使細胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進而促使質(zhì)膜的融合；另外，PEG能增加類脂膜的流動性，也使細胞的核、細胞器發(fā)生融合成為可能。,PEG誘導融合的特點：其優(yōu)點是融合成本低，勿需特殊設備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。其缺點是融合過程繁瑣，PEG可能對細胞有毒害。,聚乙二醇（PEG）法細胞融合步驟（1）將兩種不同親本細胞各5×l06混勻；（2）離心沉淀，吸去

15、上清液；（3）加1ml 50％PEG溶液，用吸管吹打，使之與細胞接觸1分鐘；（4）加9ml 培養(yǎng)液，離心沉淀，吸去上清液；（5）加5ml 培養(yǎng)液，分別接種5個直徑60mm平皿，每個平皿加培養(yǎng) 液至 5ml，37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（6）6—24小時后，換成選擇培養(yǎng)液篩選雜交細胞。,三、電融合法,電融合法是80年代出現(xiàn)的細胞融合技術，在直流電脈沖的誘導下，細胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細胞粘合并發(fā)

16、生質(zhì)膜瞬間破裂，進而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。電融合法的優(yōu)點：融合率高、重復性強、對細胞傷害??；裝置精巧、方法簡單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過程；免去PEG誘導后的洗滌過程、誘導過程可控性強。,電融合的基本過程：細胞膜的接觸：當原生質(zhì)體置于電導率很低的溶液中時，電場通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；膜的擊穿：原生

17、質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導致兩個緊密接觸的細胞融合在一起。,電融合誘導法原理示意圖,第三節(jié) 雜種細胞的篩選,根據(jù)已經(jīng)發(fā)生融合的細胞中所含有核的類型，可將其分為以下幾種類型：異核細胞：非同源細胞的融合體。同核細胞：兩個相同細胞的融合體。多核細胞：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體。,基于酶缺陷型細胞和藥物抗性所建立的雜種篩選基于營養(yǎng)缺陷型細胞所建立的雜種篩選由溫度敏感型細胞組成的雜種細胞的篩選

18、具有所需性狀雜種細胞的篩選,常用的雜種細胞篩選方法,第四節(jié) 細胞雜交瘤技術與單克隆抗體,一、何謂單克隆抗體？,只針對某一抗原決定簇的抗體分子稱為單克隆抗體。,單克隆抗體技術的核心是用骨髓瘤細胞(myeloma cell)與經(jīng)特定抗源免疫刺激的B淋巴細胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得到雜交瘤細胞(hybridoma cell)，雜交瘤細胞既能象骨髓瘤細胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細胞產(chǎn)

19、生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術又稱為雜交瘤技術(hybridoma technology ）。,Niels K. Jerne,G. Kohler,C. Milstein,二、雜交瘤技術的基本原理,三、雜交瘤細胞的制備,（一）骨髓瘤細胞選擇及選擇性培養(yǎng)基,骨髓瘤細胞本身不能分泌抗體選擇次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）,,HAT培養(yǎng)基,次黃嘌呤（hypoxanthine，H）

20、氨基喋呤（aminopterin， A）胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine， T）,次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）,,（二）免疫小鼠,免疫程序是取6—8周齡Balb／C雌鼠，基礎免疫2周，靜脈再加強免疫一次，3—5天后用于融合。免疫時是否采用佐劑和事先處理抗原，要依抗原性的強弱而定。一般來講可溶性抗原用完全佐劑效果較好。抗原量同樣與抗原強弱有關，以IgG為例，第一次為loo?g，

21、第二次為50?g，免疫途徑第一次可經(jīng)腹腔注射。對于細胞性抗原不用佐劑，每次腹腔注射1×l06一1×107。,（三）脾細胞的制備,(1)引頸處死小鼠，用酒精消毒體表；(2)無菌條件下取出脾臟，剃除結締組織和脂肪，用5ml無血清培養(yǎng)液沖洗一次；(3)把脾臟置于已消毒的90一100目不銹鋼網(wǎng)或尼龍紗網(wǎng)中；(4)在脾中部切開一小口，用注射器芯從一端輕輕壓擠，再用無血清培養(yǎng)液沖洗， 令細胞通過紗網(wǎng)，收集入平皿中，

22、或用注射器向脾臟內(nèi)注入3ml無血清培養(yǎng) 液，反復抽吸數(shù)次方法獲取細胞，再制成細胞懸液亦可；(5)把細胞懸液注入50ml離心管中，加l0一20ml培養(yǎng)液：輕輕吹打數(shù)次，室溫中 置5分鐘；(6)離心(800一1000轉(zhuǎn)／分)計數(shù)、備用。,,（四）細胞準備,（1）收集骨髓瘤細胞，用無血清培養(yǎng)液洗3次(37℃)，計數(shù)活力細胞(不少于90％)；（2）收集小鼠脾細胞，用無血清培養(yǎng)液洗3次(37℃)，并計細胞數(shù)和測定活力細胞；

23、（3）按1：5或1：10混合脾細胞和骨髓瘤細胞后，離心棄去上清，并以消毒濾 紙吸 凈多余上清。,（五）細胞融合,(1)將1ml 40％的PEG液一滴滴加入列細胞團中，在60秒內(nèi)加完，同時并不斷輕微 轉(zhuǎn)動離心管或用手指輕彈離心管；(2)在不斷轉(zhuǎn)動離心管中加1ml無血清培養(yǎng)液，60秒鐘內(nèi)加完；(3)于5分鐘內(nèi)慢慢加完20ml無血清培養(yǎng)液；此時細胞對機械損傷非常敏感，(4)離心(800轉(zhuǎn)／分，8分鐘)，去上清，用完全培

24、養(yǎng)液10ml懸浮，輕輕混勻；(5)取96孔板，每孔加50?l；(6)取等體積細胞懸液，向另一96孔板中加50P1；(7)送入5％CO2，溫箱中37℃培養(yǎng)，24小時后更換成HAT選擇性培養(yǎng)掖。,（六）融合后細胞培養(yǎng),(1)融合后7—10天用HAT培養(yǎng)液半量換液(留一半舊的加一半新的) 后每隔2—3天 半量換液一次；(2)兩周后可改用HA培養(yǎng)液半量換液，或仍用HAT培養(yǎng)液；(3)2—3周后出現(xiàn)雜交細胞集落，細胞個大、圓且透明

25、；(4)待集落增殖生長至1／3孔時，應進行抗體檢測。,,HAT培養(yǎng)基,次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin， A）胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine， T）,次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）,（七）抗體檢測,免疫熒光試驗放射免疫試驗(RIA)聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA),（八）單克隆抗體的大量制備,體內(nèi)法培養(yǎng)法,四、單克隆抗體的應用,單

26、克隆抗體具有高度的特異性與靈敏性，可以廣泛地由于臨床醫(yī)學的疾病 診斷，以提高疾病診斷的準確性。利用單克隆抗體技術可以生產(chǎn)各種免疫疫苗，這不僅能大大降低生產(chǎn)成 本，同時也增加了疫苗的安全性。單克隆抗體還有可能用于某些腫瘤的治療，是人類戰(zhàn)勝癌癥十分有望的潛 在技術。單克隆抗體技術還可廣泛用于各種基礎醫(yī)學研究，從而推動現(xiàn)代醫(yī)學的不 斷發(fā)展。,第五節(jié) 人源單克隆抗體,主要困難（1）缺乏合適的人骨髓瘤細胞株作為融合親本

27、?，F(xiàn)有的細胞株大多是融合率不高，雜交瘤抗體產(chǎn)生水平低，而且細胞不穩(wěn)定，易喪失抗體分泌能力；（2）獲得抗原特異的人B淋巴細胞十分困難，因為對人來說，高度免疫獲得抗原特異的B淋巴細胞的方法顯然是不可行的；（3）大量繁殖雜交瘤細胞以獲得所需量的抗體，鼠類雜交瘤可通過小鼠腹腔接種雜交瘤細胞誘生腹水達到這一目的，但是人雜交瘤細胞在鼠類中誘生腹水是很困難的。,本章小結,細胞融合又稱體細胞雜交，是兩個或更多個相同或不同細胞通過膜 融 合

28、形成單個細胞的過程。細胞融合的方法主要有生物法（仙臺病毒法）、化學法（聚乙二醇 法）和物理法（電融合法）。雜合細胞的篩選方法主要有基于酶缺陷型細胞和藥物抗性所建立的雜 種篩選、基于營養(yǎng)缺陷型細胞所建立的雜種篩選、由溫度敏感型細胞 組成的雜種細胞的篩選及具有所需性狀雜種細胞的篩選。基于細胞融合的雜交瘤技術和單克隆抗體技術具有廣泛的應用價值。,植物融合細胞成長狀態(tài)對比,右瓶為地面融合的細胞，左瓶中為太空微重力