利用轉(zhuǎn)基因方法研究人胚胎干細胞特異性表達新基因HESRG的亞細胞定位和功能.pdf

1、人胚胎干細胞(ES細胞)是從植入前早期胚胎內(nèi)細胞團(ICM)或原始生殖細胞(PGCs)中分離得到并能在體外長期培養(yǎng)的高度未分化的全能細胞系。在體外特定的、適宜的培養(yǎng)體系中，人ES細胞可長期無限增殖，同時仍保持不分化狀態(tài)和多向分化潛能。在體外可以誘導(dǎo)其分化成特定組織的成熟細胞，如神經(jīng)細胞、心肌細胞、胰島細胞和造血細胞等，成為神經(jīng)退行性疾病、心肌梗塞、糖尿病和血液病等疾病細胞移植治療的一個重要細胞來源。人ES細胞系首先是由Thomson等和

2、Shamblott等于1998年分別從ICM和PGCs建立。人ES細胞一經(jīng)建立便立即成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最具吸引力的熱點。 人ES細胞體外培養(yǎng)條件比較苛刻，條件不宜時容易自發(fā)分化。人ES細胞體外培養(yǎng)方式可分為有飼養(yǎng)層培養(yǎng)和無飼養(yǎng)層培養(yǎng)。有飼養(yǎng)層培養(yǎng)即將人ES細胞培養(yǎng)在鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)上，然而該培養(yǎng)方式易引起鼠源性蛋白的污染而給人ES細胞的臨床運用帶來困擾。無飼養(yǎng)層培養(yǎng)則是使用源于MEFs并添加了堿性成纖維細胞生長因子(b

3、FGF)的條件培養(yǎng)基(CM培基)進行培養(yǎng)，其操作較繁瑣，費用較高，不適于大規(guī)模培養(yǎng)。要找到一種合適、簡便高效的人ES細胞培養(yǎng)方法，首先必須了解人ES細胞維持自我更新和多潛能性的分子機制。最近，有多個研究小組報道通過在成體細胞中過表達多個與ES細胞自我更新相關(guān)的基因可逆轉(zhuǎn)成體細胞的分化狀態(tài)，誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)變成多潛能的干細胞。這些研究不僅為干細胞臨床移植治療開辟了新的道路，同時也凸顯了ES細胞自我更新機制研究的重大意義。文獻報道顯示：多種因素參與

4、調(diào)控人ES細胞自我更新，其中包括轉(zhuǎn)錄因子(Oct-3/4、Nanog、Sox2等)、信號通路(TGFβ信號通路、Wnt信號通路、FGF和P13K信號通路等)、細胞周期調(diào)控因子、microRNA、染色體穩(wěn)定性及DNA甲基化等。Oct-3/4、Nanog、Sox2是目前研究較多的參與調(diào)控人ES細胞自我更新的轉(zhuǎn)錄因子，它們之間可相互作用形成復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控環(huán)路，共同維持人ES細胞的多潛能性。除了上述幾個關(guān)鍵基因之外，近來研究表明人ES細胞中還存

5、在其它已知或未知基因參與其自我更新的調(diào)控過程，然而它們在人ES細胞中的功能及調(diào)控機制遠未闡明。 本實驗室通過比較未分化的人ES細胞(H9細胞)和7天擬胚體(7-day EBs)的基因表達譜，通過EST拼接、5’-RACE等方法克隆得到的一個人胚胎干細胞特異性表達新基因并命名為人胚胎干細胞相關(guān)基因(HESRG)。生物信息學(xué)預(yù)測HESRG有兩個候選開放閱讀框(ORFs)，分別命名為HESRG1、HESRG2。HESRG1的起始密碼子

6、CTG位于2-4bp處，終止密碼子位于668-670bp處；編碼由222個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，預(yù)測分子量為24kD。HESRG2的起始密碼子ATG位于2245-2247bp處，終止密碼子位于2485-2487bp處，編碼由80個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，預(yù)測分子量為8.7kD。然而生物信息學(xué)預(yù)測的結(jié)果仍需要進一步的實驗證實，因此本課題的主要研究目的有兩個： 一、確定HESRG基因的ORF及其編碼蛋白的亞細胞定位； 二、

7、利用轉(zhuǎn)基因策略研究過表達HESRG對人ES細胞生物學(xué)特性的影響。 【檢測HESRG1的蛋白表達、亞細胞定位及過表達HESRG1對人ES細胞生物學(xué)性狀的影響】 HESRG1為HESRG基因的候選ORF之一，通過RT-PCR方法克隆HESRG1序列，將該序列克隆至pEF/His(C)載體與pCMV-Tag4A載體中，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒(pEF/HESRG1，pcflag-HESRG1)。利用Fugene 6轉(zhuǎn)染試劑將pEF/H

8、ESRG1導(dǎo)入H9細胞，通過G418篩選獲得抗性克隆，進一步采用RT-PCR，Real-time PCR檢測HESRG1的mRNA表達，Western blot檢測Xpress與HESRG1融合蛋白的表達。將pcflag-HESRG1導(dǎo)入H9細胞，72小時后通過間接免疫熒光實驗觀察flag與HESRG1融合蛋白的亞細胞定位。Westernblot結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEF/HESRG1的H9細胞(H9-HESRG1細胞)中可檢測到融

9、合蛋白的表達，同時間接免疫熒光實驗結(jié)果表明HESRG1蛋白分布于細胞核內(nèi)，與生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果一致，推斷HESRG1是HESRG基因的ORF。 隨后檢測過表達HESRG1對人ES細胞的生物學(xué)特性的影響,實驗結(jié)果顯示，人ES細胞過表達HESRG1后，其細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，不再呈克隆性生長的未分化ES細胞形態(tài)，而變成多形性、分散生長的、分化的人ES細胞形態(tài)，而且細胞的增殖速度明顯減慢。Real-time PCR在mRNA水平檢測人

10、ES細胞多潛能標志基因Oct-3/4、Nanog，外胚層標志基因Sox1、FGF5、Nestin，中胚層標志基因BRAHYURY(T)、Hand1，內(nèi)胚層標志基因GATA4、GATA6，滋養(yǎng)層標志基因CGα和CGβ的表達情況，結(jié)果顯示中胚層標志基因Hand1明顯上調(diào)，而其它胚層標志基因改變不明顯。間接免疫熒光在蛋白質(zhì)水平檢測各胚層分化標志基因(Nestin、Hand1、GATA4)的表達，結(jié)果顯示H9-HESRG1細胞內(nèi)中胚層標志基因H

11、and1表達呈強陽性，而其它胚層標志基因無明顯改變，說明過表達HESRG1將促使人ES細胞向中胚層方向分化。平板克隆實驗觀察H9-HESRG1細胞的克隆形成能力，結(jié)果顯示H9-HESRG1細胞克隆形成能力低下。同時MTT法檢測細胞的增殖能力，結(jié)果表明H9-HESRG1細胞的增殖能力明顯低于轉(zhuǎn)染空載體的H9細胞(H9-EF1細胞)。證實過表達HESRG1將會導(dǎo)致人ES細胞增殖能力、克隆形成能力均下降。 【檢測HESRG2的蛋白表達

12、及其過表達對人ES細胞生物學(xué)性狀的影響】 HESRG2為HESRG基因的第二個候選ORF。通過RT-PCR的方法擴增HESRG2序列，將該序列克隆到pEF/His(B)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒(pEF/HESRG2)。將pEF/HESRG2導(dǎo)入H9細胞，經(jīng)G418篩選獲得抗性克隆(H9-HESRG2細胞)，進一步通過RT-PCR，Real-time PCR在mRNA水平上檢測HESRG2的表達，Western blot檢測Xpres

13、s與HESRG2融合蛋白的表達情況。結(jié)果表明無法在H9-HESRG2細胞中檢測到融合蛋白的表達。 隨后檢測了過表達HESRG2對人ES細胞的生物學(xué)特性的影響,H9-HESRG2細胞與未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染空載體的人ES細胞(H9-EF2細胞)在形態(tài)上無明顯差異，均表現(xiàn)為未分化人ES細胞的形態(tài)。MTT法測定細胞生長曲線，觀察H9-HESRG2細胞增殖能力。結(jié)果顯示，過表達HESRG2對人ES細胞的增殖能力沒有明顯影響。流式細胞分析結(jié)果表明過

14、表達HESRG2后，H9-HESRG2細胞的周期分布(包括G1期、S期和G2-M期)沒有明顯改變。通過擬胚體形成實驗，檢測H9-HESRG2細胞的體外分化能力，未發(fā)現(xiàn)H9-HESRG2細胞與H9-EF2細胞形成的擬胚體在形態(tài)上有明顯差別。同時采用RT-PCR方法檢測不同時期兩組細胞形成擬胚體中各個胚層標志基因的表達情況，結(jié)果也顯示H9-HESRG2細胞與H9-EF2細胞形成的擬胚體各個胚層標志基因在相同時期沒有顯著差異。 綜上所

15、述，認為HESRG2可能位于HESRG基因的非翻譯區(qū)，并不編碼蛋白質(zhì)，過表達HESRG2對人ES細胞的生物學(xué)特性沒有顯著影響。 總之，通過本課題研究，認為HESRG1是HESRG基因的ORF，編碼的蛋白質(zhì)定位于細胞核內(nèi)；HESRG的表達水平須保持在一定的范圍內(nèi)才能維持人ES細胞的未分化狀態(tài)，過表達HESRG1能促使人ES細胞向中胚層方向分化，并導(dǎo)致人ES細胞的增殖能力及克隆形成能力明顯下降；HESRG2可能位于HESRG基因的非