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文檔簡介
1、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一種上皮細胞的惡性腫瘤。我國是世界上鼻咽癌發(fā)病率和死亡率水平較高的國家之一。由于鼻咽癌是一種低分化、高轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤,其治療失敗的主要原因仍然為局部區(qū)域性復發(fā)與遠處轉(zhuǎn)移,因而侵襲和轉(zhuǎn)移仍是導致鼻咽癌患者死亡的主要原因。從組織學的角度分析,鼻咽癌絕大部分(95%以上)屬于惡性度高的未分化或低分化癌,癌細胞易于擴散轉(zhuǎn)移。故研究鼻咽癌的侵襲機制有重要意義。
zest
2、e基因增強子同源物2(Enhancer of Zeste Homolog2,EZH2)是多梳抑制復合物2(Polycomb Repressor Complex2,PRC2)的核心組分,其高度保守的SET區(qū)域具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性,通過催化靶基因啟動子區(qū)組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化(Trimethylatedlysine27 of histone H3,H3K27me3),從而抑制基因轉(zhuǎn)錄,在染色體水平調(diào)控基因活性。有研究表明,EZ
3、H2可通過不依賴于其組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性的作用影響細胞骨架聚合,從而在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用。已發(fā)現(xiàn)EZH2在鼻咽癌、前列腺癌和乳腺癌等多種腫瘤組織中過表達,且其表達水平與腫瘤大小、浸潤深度、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遷徙及侵襲能力、預后等因素密切相關(guān),提示EZH2有望成為鼻咽癌診斷及抗腫瘤治療的新靶點。
Rho相關(guān)的卷曲蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil containing protein ki
4、nase,ROCK)是RhoA的下游效應蛋白,在哺乳動物體內(nèi)主要有ROCK1和ROCK2兩種異構(gòu)體。ROCK1蛋白的過表達能夠調(diào)節(jié)細胞骨架的重組、促進應力纖維和點狀粘附的形成,從而調(diào)節(jié)細胞的運動和遷移能力。
南蛇藤(Celastrus orbieulatus Thunb),衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物。始載于清代《植物名實圖考》,又名過山楓、過山龍、黃果藤、香龍草等。我國南蛇藤屬植物30種,分布廣泛,多野生于山地溝谷、山坡灌木叢中。主要
5、用于治療風濕性關(guān)節(jié)炎、痢疾、小兒驚風、跌打損傷、腫毒等病癥。南蛇藤含有多種藥理成分,如萜類、脂肪類以及苷類等。這些成分具有廣泛的藥理作用,如抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗微生物以及抗纖維化和抗生育等。特別值得關(guān)注的是其在抗腫瘤方面的顯著作用。本課題組前期研究顯示,南蛇藤莖乙酸乙酯提取物(C orbiculatus ethyl acetate extracts,COE)有顯著的抗腫瘤作用,但其機制還未完全闡明。目前已知的南蛇藤莖乙酸乙酯提取物抗
6、腫瘤的機制主要為抑制消化系統(tǒng)腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移,促進其凋亡,并抑制胃癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。在本研究中,我們將研究南蛇藤莖乙酸乙酯提取物對鼻咽癌EZH2基因的抑制作用及其對鼻咽癌增殖和侵襲抑制作用的分子機制。
研究共分為四部分內(nèi)容。
第一部分鼻咽癌中EZH2、ROCK1蛋白表達及其臨床意義
目的:確定EZH2、ROCK1蛋白在鼻咽癌中的表達,并評估EZH2、ROCK1蛋白與鼻咽癌的臨床病理學特征之問的關(guān)系。確
7、定EZH2在鼻咽癌細胞中可以調(diào)控ROCK1蛋白的表達。
方法:免疫組織化學檢測NPC患者病理切片標本中EZH2和ROCK1的表達水平。Western blot及PCR檢測慢病毒敲低EZH2表達的人鼻咽癌5-8F細胞(shEZH25-8F)與轉(zhuǎn)染scramble shRNA慢病毒的對照組人鼻咽癌5-8F細胞(shCtrl5-8F)中ROCK1的表達。
結(jié)果:對腫瘤病理切片進行免疫組織化學染色,檢測腫瘤中EZH2、ROC
8、K1蛋白表達情況及其與臨床因素的聯(lián)系。發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者組織中EZH2與ROCK1蛋白表達顯著正相關(guān)。EZH2蛋白表達水平與患者的T分期、N分期、AJCC分期正相關(guān)。ROCK1蛋白表達水平與患者的N分期正相關(guān)。Western blot結(jié)果表明,shEZH25-8F細胞ROCK1蛋白表達顯著低于對照組,PCR結(jié)果表明,shEZH25-8F細胞中ROCK1的表達比shCtrl5-8F組顯著下降。
結(jié)論:EZH2和ROCK1高表達與鼻咽
9、癌的進展有關(guān)。敲低EZH2基因可以抑制鼻咽癌細胞中ROCK1蛋白和基因的表達。靶向EZH2/ROCK1通路可以給鼻咽癌的治療提供新方向。
第二部分EZH2影響鼻咽癌增殖和侵襲的實驗研究
目的:研究EZH2對5-8F鼻咽癌細胞增殖和侵襲的影響。PCR芯片分析shEZH25-8F與shCtrl5-8F細胞中差異表達的癌基因及抑癌基因。研究EZH2對裸鼠鼻咽癌5-8F細胞皮下移植瘤生長的影響。
方法:MTS實驗觀
10、察增殖能力的改變;Transwell實驗檢測體外遷移、侵襲能力的變化;裸鼠10只,隨機選擇5只皮下接種人鼻咽癌細胞株shCtrl5-8F,其余5只皮下接種人鼻咽癌細胞株shEZH25-8F。接種14d后處死老鼠,剝脫腫瘤組織,檢測腫瘤體積及重量。PCR芯片比較shEZH25-8F與shCtrl5-8F細胞癌基因及抑癌基因改變。
結(jié)果:MTS法檢測5-8F、shCtrl5-8F、shEZH25-8F細胞種板24、48、72小時后
11、的細胞增殖情況。結(jié)果提示shEZH25-8F較shCtrl5-8F增殖能力均明顯降低(P<0.05),5-8F與shCtrl5-8F細胞增殖能力無統(tǒng)計學差異。
Transwell小室法檢測5-8F、shCtrl5-8F、shEZH25-8F細胞遷移及侵襲(24小時),shEZH25-8F較shCtrl5-8F細胞遷移及侵襲能力降低(P<0.05),5-8F與shCtrl5-8F細胞遷移及侵襲能力無統(tǒng)計學差異。
PCR
12、芯片結(jié)果提示shEZH25-8F較shCtrl5-8F細胞,APC、ATM、ESR1、MYCN、RET、TGFB1、WT1和ZHX2這8個基因表達上調(diào)>3倍,NFKB1和TP53這兩個基因下調(diào)>3倍。
體內(nèi)研究證實,與陰性對照組相比,shEZH25-8F組細胞腫瘤體積顯著減小。shEZH25-8F組瘤重顯著低于陰性對照組(P<0.05)。
結(jié)論:EZH2被敲低后能抑制鼻咽癌5-8F細胞增殖、侵襲和遷移,并且可以抑制裸
13、鼠皮下鼻咽癌移植瘤的生長。因此,EZH2可能成為治療鼻咽癌轉(zhuǎn)移的靶點。其機制可能與其調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因相關(guān)。
第三部分南蛇藤提取物通過阻斷EZH2/ROCK1通路抑制鼻咽癌細胞增殖和侵襲的體外研究
目的:明確南蛇藤提取物(Extract of Celastrus orbiculatus,COE)通過EZH2/ROCK1信號通路對鼻咽癌細胞的增殖和侵襲具有調(diào)控作用,闡明COE在抑制鼻咽癌細胞增殖和侵襲中的作用和機制。
14、
方法:鼻咽癌5-8F細胞分別經(jīng)不同濃度(0,6.25,12.5,25,50及100ug/mL)的COE處理后,MTS法觀察增殖能力的改變;流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡;Transwell實驗檢測體外遷移和侵襲能力的變化;Westernblot及實時熒光定量PCR法分析EZH2、ROCK1蛋白和基因的表達水平,Westernblot及實時熒光定量PCR實驗以EZH2抑制劑(DZNeP)作為陽性對照。
結(jié)果:不同濃度(0,
15、6.25,12.5,25,50及100ug/mL)的COE作用24h,對5-8F細胞的增殖有抑制作用,并呈明顯的劑量依賴性。藥物作用24h時,5-8F細胞在12.5-100μg/ml濃度組的生長存活率與本細胞對照組相比均有統(tǒng)計學差異(P<0.05); COE對5-8F細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為70.02μg/ml(24h)。
不同濃度(0,6.25,12.5,25,50,100μg/ml) COE作用24 h可促進5-8
16、F細胞凋亡,并有明顯的劑量依賴性。5-8F細胞在100μg/ml濃度組的凋亡率與對照組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.05);因此使用低于100μg/ml濃度的COE進行以下實驗,以確保COE對鼻咽癌細胞的作用不是通過直接的細胞毒作用。
使用Transwell檢測細胞遷移和侵襲。遷移和侵襲實驗結(jié)果提示不同濃度(12.5,25,50μg/ml) COE作用24 h時,5-8F細胞在12.5-50μg/ml濃度組穿過小室的細胞與對照組相
17、比均有統(tǒng)計學差異(P<0.05);并有明顯的劑量依賴性。
使用WB檢測不同濃度(0,12.5,25,50μg/ml) COE或2μM DZNeP(EZH2抑制劑)作用24 h后5-8F細胞EZH2和ROCK1蛋白變化。EZH2蛋白在COE25-50μg/ml濃度組與對照組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。 ROCK1蛋白在COE12.5-50μg/ml濃度組與對照組相比均有統(tǒng)計學差異(P<0.05);并有明顯的劑量依賴性。CO
18、E高劑量組與DZNeP對EZH2、ROCK1蛋白的抑制作用接近。
使用PCR檢測EZH2和ROCK1 mRNA變化。不同濃度(0,12.5,25,50μg/ml)COE或2μM DZNeP作用24 h時,EZH2和ROCK1 mRNA在12.5-50μg/ml COE濃度組與對照組相比均有統(tǒng)計學差異(P<0.05);并有明顯的劑量依賴性。DZNeP與COE高劑量組對ROCK1 mRNA的抑制作用接近,但DZNeP不能降低EZH
19、2 mRNA的表達量。
結(jié)論:南蛇藤提取物可通過下調(diào)EZH2/ROCK1信號通路抑制鼻咽癌細胞增殖、促進其凋亡,并降低其體外遷移和侵襲的能力。
第四部分南蛇藤提取物通過阻斷EZH2/ROCK1通路抑制鼻咽癌細胞增殖的體內(nèi)研究
目的:證實COE通過EZH2/ROCK1信號通路對鼻咽癌皮下移植瘤增殖具有調(diào)控作用,闡明COE在抑制人鼻咽癌皮下移植瘤增殖中的作用和機制。
方法:裸鼠42只,隨機選擇6只進入
20、正常組,其余36只均于右側(cè)背部皮下接種人鼻咽癌5-8F細胞株。待瘤塊直徑約5mm-6mm大小時,將裸鼠隨機分為對照組(1%DMSO)、COE高、中、低劑量(50,25,12.5mg/kg)組及替吉奧組(10mg/kg),參一膠囊組(10mg/kg),每組6只。分組當天開始給藥,COE連續(xù)21d,替吉奧連續(xù)14d,參一膠囊連續(xù)21d,末次藥24 h后,檢測腫瘤重量,免疫組化檢測移植瘤組織內(nèi)EZH2、ROCK1蛋白表達水平的變化,HE染色檢
21、測瘤組織內(nèi)腫瘤壞死區(qū)域。
結(jié)果:與陰性對照組相比,COE各治療組腫瘤生長速度減緩。陰性對照組瘤重(1.58±0.74g),COE低、中、高劑量組平均瘤重分別為1.36±0.53g,1.26±0.52g和0.88±0.53。COE高劑量組移植瘤重量與對照組相比有顯著性差異(P<0.05),抑制作用具有劑量依賴性。陽性對照替吉奧組平均瘤重為0.86±0.43g,與COE高劑量組抑制作用接近。中藥對照參一膠囊平均瘤重為1.26±0.
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