MiR-145通過靶向作用于Smad3抑制鼻咽癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力.pdf

1、目的：鼻咽癌是頭頸外科腫瘤中常見的癌癥，具有高度的轉(zhuǎn)移能力，在亞洲地區(qū)較為流行，特別是在中國南方。隨著表觀遺傳學(xué)的不斷發(fā)展，近年來 miRNA在多種腫瘤中的各種生物學(xué)作用越來越受到科研工作者的重視。miR-145被報道在多種腫瘤中發(fā)揮抑制腫瘤的作用，并且已有報道m(xù)iR-145在鼻咽癌組織中明顯低表達，但其功能仍未有報道。
　　本研究旨在驗證miR-145在鼻咽癌組織標(biāo)本及鼻咽癌細(xì)胞中的表達情況，通過探討鼻咽癌中miR-145的生物

2、學(xué)功能及其可能的調(diào)控機制，為鼻咽癌的診斷和治療提供確鑿的實驗依據(jù)和新的方向。
　　方法：（1）采用Real-Time PCR和Western Blot方法分別檢測在人永生化的鼻咽部上皮細(xì)胞NP69和3株鼻咽癌細(xì)胞（CNE-1、CNE-2和CNE-2Z）以及11對鼻咽癌組織樣本中miR-145的表達水平。（2）將miR-145的模擬體miR-145 mimics（miR-NC）和抑制劑miR-145 inhibitor（miR-NC

3、 inhibitor）轉(zhuǎn)染至高轉(zhuǎn)移的鼻咽癌細(xì)胞株（CNE-2和CNE-2Z）中，通過CCK-8實驗觀察細(xì)胞的增殖情況，以及Transwell實驗了解其對細(xì)胞遷移、侵襲的影響。（3）生物信息學(xué)軟件 TargetScan、PicTar和 miRanda對miR-145的靶基因進行預(yù)測，初步篩選出目的基因Smad3。運用雙熒光素酶活性檢測實驗驗證相關(guān) miR-145是否與 Smad33’UTR區(qū)域的種子序列直接靶向結(jié)合，驗證靶基因。在鼻咽癌細(xì)

4、胞株中過表達和抑制表達miR-145后檢測 Smad3 mRNA和蛋白表達水平。（4）將si-Smad3（si-NC）轉(zhuǎn)染至鼻咽癌細(xì)胞中，使用Western Blot技術(shù)檢測Smad3的蛋白表達情況，以確保干擾Smad3的效果，通過CCK-8方法觀察細(xì)胞的增殖情況，及應(yīng)用Transwell試驗了解其對細(xì)胞遷移、侵襲的影響。（5）qRT-PCR方法檢測在人永生化的鼻咽部上皮細(xì)胞NP69和3株鼻咽癌細(xì)胞以及11對鼻咽癌組織樣本中Smad3的

5、表達情況，并將其和miR-145的表達作回歸分析，統(tǒng)計出鼻咽癌中miR-145和Smad3表達的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　?。?）與NP69相比，miR-145在鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1、CNE-2和CNE-2Z的表達均是明顯下調(diào)的；同樣，與11例鼻咽部非腫瘤組織相比，11例鼻咽癌組織樣本中miR-145表達下調(diào)。綜上所述，miR-145在鼻咽癌中低表達。
　　（2）在轉(zhuǎn)染miR-145 mimics后CNE-2和CNE-

6、2Z細(xì)胞株細(xì)胞增殖明顯減慢，細(xì)胞的遷移及侵襲能力顯著下降。而在轉(zhuǎn)染miR-145 inhibitor后，呈現(xiàn)出相反的結(jié)果。
　?。?）生物信息學(xué)軟件預(yù)測分析出可能與miR-145特異結(jié)合的靶基因的3’UTR區(qū)，通過瞬時轉(zhuǎn)染miR-145 mimics（miR-NC）和miR-145 inhibitor（miR-NC inhibitor）檢測靶基因在mRNA和蛋白水平的表達改變情況以及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C，最后得出Smad3作

7、為miR-145的目的基因成為本次研究的靶基因。
　　（4）將si-Smad3轉(zhuǎn)染到CNE-2和CNE-2Z細(xì)胞株后，我們發(fā)現(xiàn)Smad3的蛋白表達水平明顯下降，表明si-Smad3成功地干擾了Smad3的表達，生物學(xué)功能實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染 si-Smad3后細(xì)胞增殖未見明顯變化，細(xì)胞的遷移及侵襲能力下降。表明鼻咽癌中Smad3可能主要發(fā)揮促進鼻咽癌轉(zhuǎn)移的作用。
　　(5)與NP69相比，在鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1、CNE-2和C

8、NE-2Z中Smad3的表達明顯上調(diào)；在11例鼻咽癌組織樣本中檢測得到Smad3的表達與11例鼻咽部非腫瘤組織相比也是上調(diào)的。也就是說，在鼻咽癌中Smad3是高表達的。將其和miR-145的表達作回歸分析發(fā)現(xiàn)鼻咽癌中兩者的表達之間是呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　本實驗表明miR-145在人鼻咽癌中呈現(xiàn)低表達水平，通過發(fā)揮抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，進而發(fā)揮抑制腫瘤的作用。利用生物信息學(xué)和雙熒光實驗等方法發(fā)現(xiàn)并驗證miR