南蛇藤莖提取物調(diào)控Notch1抑制肝癌血管擬態(tài)的作用及機制.pdf

1、引言
　　原發(fā)性肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種高度異質(zhì)性、癌性血管豐富的惡性實體腫瘤，早期診斷率低。根治性切除或肝臟移植后大部分病例在2年內(nèi)形成肝內(nèi)復發(fā)或肝外轉(zhuǎn)移，5年生存率較低。中晚期患者由于受基礎(chǔ)肝功能的影響，目前尚缺乏反應率高且相對安全的治療措施。因此肝癌的綜合治療策略亟待進一步研究及補充。
　　傳統(tǒng)的抗內(nèi)皮細胞依賴性血管(endothelial dependent ves

2、sel，EDV)生成在實體腫瘤治療中的不理想，提示了可能存在另外一種相對獨立的微血管系統(tǒng)參與腫瘤血供。擬態(tài)血管(vasculogenic mimicry，VM)是由腫瘤細胞獨立形成的、參與腫瘤血供及轉(zhuǎn)移的微血管結(jié)構(gòu)，它的形成是腫瘤細胞自身塑性改變以及腫瘤細胞與局部微環(huán)境相互作用的結(jié)果，多種腫瘤基因及血管生成調(diào)節(jié)基因參與其中。惡性腫瘤中VM的形成多與不良預后密切相關(guān)。
　　Notch基因目前發(fā)現(xiàn)4種(Notch1-4)亞結(jié)構(gòu)，是哺乳

3、動物胚胎發(fā)育過程中重要的調(diào)控基因。在胚胎后的腫瘤形成及進展、組織纖維化、血管生成中發(fā)揮重要作用。Notch基因在黑色素瘤及乳腺癌的血管擬態(tài)中均發(fā)揮重要作用。而關(guān)于Notch1在肝癌血管擬態(tài)形成中的作用及機制，目前鮮有報道。
　　肝癌中醫(yī)稱為肝積，屬于現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合理論中的絡病范疇。肝癌的血管生成是一種病絡的綜合表現(xiàn)，其病機要素為“虛、瘀、毒”。病絡是肝癌生長和轉(zhuǎn)移的主要途徑。理論上講肝癌的血管擬態(tài)亦是一種病絡。根據(jù)“辛以通絡”原則

4、，辛藥具有活血祛瘀、解毒散結(jié)功效的可發(fā)揮抑制病絡的作用。目前一些基礎(chǔ)研究顯示具備上述性味的中藥能夠抑制血管擬態(tài)的形成。
　　南蛇藤（Celastrus Orbiculatus Thunb）系衛(wèi)茅科藤屬藥用植物，全草入藥，苦溫微辛，入肝與膀胱經(jīng)，功能行氣活血、祛毒消腫。課題組前期的研究證實南蛇藤莖乙酸乙酯提取物(Celastrus Orbiculatus Extraction，COE)能夠抑制肝癌的內(nèi)皮依賴性血管生成;抑制胃癌細胞的

5、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）減少胃癌裸鼠模型的轉(zhuǎn)移。但是，關(guān)于COE能否調(diào)控Notch1抑制肝癌的血管擬態(tài)，目前未檢索到相關(guān)的文獻報道。為此，本研究圍繞這一核心問題，從以下四個部分展開相應的研究，力圖證實:1）Notch1在肝癌血管擬態(tài)中的作用及可能的機制;2）COE能否通過調(diào)控Notch1抑制血管擬態(tài)，進而抑制肝癌的生長。通過本課題的開展，以期為肝癌的中醫(yī)藥治療提供理

6、論及實驗依據(jù)。
　　本課題共分為四個研究部分。
　　第一部分 Notch1在肝癌組織中的表達及其與血管擬態(tài)的關(guān)系
　　目的:
　　檢測Notch1及其下游靶蛋白Hes1、EMT相關(guān)蛋白E—cadherin及vimentin在肝癌組織中的表達水平，分析Nctch1、EMT與肝癌VM的相關(guān)性;揭示VM在肝癌進展預后中的臨床意義。
　　方法:
　　收集肝癌手術(shù)標本，并根據(jù)標本來源信息對患者進行追蹤隨訪。免疫

7、組織化學染色(immunohistochemical staining，IHC)檢測Notch1、Hes1及EMT相關(guān)蛋白的表達，以RT-PCR進行驗證。PAS-CD34雙染色檢測VM，分析各蛋白表達水平與VM的相關(guān)性。應用Kaplan-Meier法繪制肝癌患者術(shù)后生存曲線，比較有無VM對術(shù)后復發(fā)的影響。
　　結(jié)果:
　　在收集的44例肝癌標本中，Notch1及Hes1在肝癌組織中的表達水平較癌旁組織明顯上調(diào)(P＜0.001

8、)。共17例(38.64％，17/44)檢出VM結(jié)構(gòu)，Notch1、Hes1的表達水平與VM檢出率呈正性相關(guān)(r=0.590，0.568，P＜0.001、0.001)。12例(27.27％，12/44)檢出肝癌細胞中vimentin表達，陽性率與VM呈正性相關(guān)(r=0.963，P＜0.001)。Notch1表達水平在Vimentin陽性標本中顯著提高(P＜0.001)。Kaplan-Meier生存分析顯示Notch1、Hes1表達升高及

9、VM陽性提示肝癌術(shù)后早期復發(fā)。
　　結(jié)論:
　　VM的出現(xiàn)會提示肝癌術(shù)后的早期復發(fā)，Notch1表達上調(diào)與肝癌EMT轉(zhuǎn)化及VM的形成存在相關(guān)性。
　　第二部分 Notch1對肝癌細胞體外血管擬態(tài)的影響
　　目的:
　　研究Notch1在肝癌細胞體外血管擬態(tài)中發(fā)揮的作用，探討其促進肝癌細胞血管擬態(tài)的機制。
　　方法:
　　通過體外三維培養(yǎng)比較低侵襲人肝癌細胞HepG2和高侵襲人肝癌細胞MHCC97

10、-H的小管形成能力，以RT-PCR及Western Blot比較兩種細胞的Notch1轉(zhuǎn)錄及表達水平，確定實驗靶細胞。繼而以慢病毒載體表達技術(shù)實現(xiàn)HepG2細胞中Notch1過表達，MHCC97-H細胞中Notch1消減表達，獲得HepG2/Notch1+及MHCC97-H/Notch1-轉(zhuǎn)化細胞。通過三維培養(yǎng)比較轉(zhuǎn)化細胞的血管擬態(tài)能力;以熒光標記的鬼筆環(huán)肽標記細胞F-actin骨架蛋白，以RT-PCR及Weatern Blot檢測vi

11、mentin及E-cadherin的轉(zhuǎn)錄及表達，觀察調(diào)控Notch1后肝癌細胞自身塑形的變化。最后，以TGF-β1誘導，觀察Notch1表達水平與肝癌細胞VM形成及EMT的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　低侵襲潛能的HepG2細胞Notch1表達水平低于高侵襲潛能的MHCC97-H細胞，不具備體外VM形成能力。在HepG2細胞中過表達Notch1后細胞EMT潛能增加，獲得體外VM形成能力;TGF-β1可以誘導HepG2細胞產(chǎn)生EMT

12、，在此過程中Notch1表達水平升高并出現(xiàn)血管擬態(tài)。在高表達Notch1的MHCC97-H細胞中敲低Notch1，肝癌細胞EMT及VM形成潛能受抑，對TGF-β1誘導的EMT及VM形成反應性降低。
　　結(jié)論:
　　Notch1的表達上調(diào)可促進肝癌細胞的EMT，進而導致VM形成，下調(diào)Notch1可阻止肝癌細胞EMT，抑制肝癌細胞VM發(fā)育。
　　第三部分 Notch1在人肝癌裸鼠皮下移植瘤內(nèi)血管擬態(tài)中的作用
　　目的

13、:
　　從整體水平探討Notch1與肝癌VM形成的關(guān)系。
　　方法:
　　應用本研究第二部分構(gòu)建的轉(zhuǎn)化細胞HepG2/vector、 HepG2/Notch1+、MHCC97-H/vector、MHCC97-H/Notch1-細胞分別接種至裸鼠左前腋下，形成不同人肝癌細胞系的裸鼠皮下移植瘤模型。每隔2d測量移植瘤長短徑，繪制腫瘤生長曲線。造模后第28d活體熒光觀察皮下移植瘤生長情況。處死動物，剝?nèi)∫浦擦龇Q重。移植瘤組織

14、病理學觀察;PAS-CD34雙染色及透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察移植瘤內(nèi)VM結(jié)構(gòu)。免疫組織化學染色法檢測移植瘤組織內(nèi)EMT標志物vimentin及E-cadherin的表達。
　　結(jié)果:
　　HepG2/Notch1+移植瘤在造模后笫20d生長加速，至實驗結(jié)束時移植瘤體積及瘤質(zhì)量均大于HepG2/vector;相反，MHCC97-H/Notch1-移植瘤在造模后第2

15、0d生長開始慢于MHCC97-H/vector，至實驗結(jié)束時瘤體積及質(zhì)量均小于MHCC97-H/vector。低表達Notch1的HepG2/vector和MHCC97-H/Notch1-移植瘤內(nèi)點、片狀壞死明顯，未觀察到典型的VM結(jié)構(gòu)。免疫組化染色顯示HepG2/Notch1+及MHCC97-H/vector移植瘤內(nèi)腫瘤細胞vimentin著色強度及著色比例高于HepG2/vector及MHCC97-H/Notch1-移植瘤;相應的，

16、E-cadherin的著色比例及強度在HepG2/Notch1+及MHCC97-H/vector移植瘤內(nèi)也較低。
　　結(jié)論:
　　Notch1可促進入肝癌裸鼠皮下移植瘤中的VM形成，抑制Notch1表達可減少VM，抑制腫瘤生長。
　　第四部分南蛇藤莖提取物調(diào)控Notch1抑制肝癌血管擬態(tài)
　　目的:
　　通過體外細胞實驗及體內(nèi)動物模型實驗，證實南蛇藤莖提取物(COE)下調(diào)Notch1表達，抑制肝癌細胞EMT

17、，減少VM形成，進而抑制腫瘤生長。
　　方法:
　　體外實驗中，首先應用CCK-8及活細胞工作站分析COE對MHCC97-H細胞增殖及匯合的抑制，在后續(xù)的實驗中選擇低于IC50的三組COE濃度(20、40、80μg/mL)進行實驗，陽性對照藥物采用Notch1特異性阻斷劑DAPT（5μM）。應用Transwell小室侵襲實驗分析COE對MHCC97-H細胞及TGF-β1誘導的HepG2細胞的侵襲抑制;采用基質(zhì)膠小管形成實驗觀

18、察COE對MHCC97-H細胞及TGF-β1誘導的HepG2細胞VM形成抑制。RT-PCR及Western Blot分析COE干預后兩種細胞Notch1、Hes1以及EMT標記物vimentin、E-cadherin的轉(zhuǎn)錄及表達水平;細胞骨架蛋白F-actin分布及表達采用熒光結(jié)合的鬼筆環(huán)肽標記。動物實驗中應用GFP標記的MHCC97-H細胞接種裸鼠皮下形成人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，造模成功后COE20、40、80mg/kg每天1次灌胃

19、給藥，DAPT20mg/kg每天1次腹腔注射作為陽性對照，生理鹽水為空白對照。每隔2d測量移植瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。第28d末次給藥后活體熒光觀察比較皮下移植瘤的熒光信號。剝?nèi)×鼋M織后稱重，切片病理觀察。PAS-CD34雙染色及TEM觀察各組血管擬態(tài)結(jié)構(gòu)。IHC檢測COE各濃度對移植瘤組織中Notch1、Hes1及EMT相關(guān)蛋白vimentin、E-cadherin表達的影響。
　　結(jié)果:
　　COE呈濃度及時間依賴性方

20、式抑制MHCC97-H細胞的增殖，作用MHCC97-H細胞24h的IC50為145.88μg/mL。COE各濃度(20、40、80μg/mL)及DAPT（5μM）處理細胞24h可有效抑制MHCC97-H及TGF-β1誘導的HepG2細胞的侵襲及VM形成，COE80μg/mL濃度組作用接近DAPT效應。Notch1及其下游靶基因Hes1在COE作用后轉(zhuǎn)錄及表達水平下降;細胞骨架重塑及vimentin表達在COE作用后受到抑制。體內(nèi)實驗結(jié)果