NLRP3炎癥小體對糖尿病性心肌病的影響及其機制研究.pdf

1、第一部分：NLRP3基因沉默改善糖尿病性心肌病的機制研究
　　研究背景：
　　糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是由糖尿病引起的，并以心肌重構和心功能下降為特征，最終導致心力衰竭的心肌病變。糖尿病狀態(tài)下，高糖刺激活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成增多被認為是DCM發(fā)生和發(fā)展的重要原因。過多的ROS刺激多種炎癥因子表達升高，如核因子kB(nuclear f

2、actor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-kB)、硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting/inhibiting protein，TXNIP)及炎癥小體。既往研究表明，炎癥小體與胰島素抵抗、2型糖尿病及糖尿病并發(fā)癥關系密切。但目前炎癥小體在DCM中的作用及其調(diào)控機制尚未見報道。
　　炎癥小體是一類分布于細胞胞漿中的蛋白復合體，它可

3、以感受細胞內(nèi)多種與免疫及死亡相關的信號刺激，參與細胞功能調(diào)控。目前已發(fā)現(xiàn)多個炎癥小體家族成員，主要包括:NLRs(nucleotide binding oligomerization domain-like receptors)家族及AIM2(absent in melanoma 2)家族。NLRP3(NOD-like receptor protein 3)是NLRs家族中的一員。當接收到相關信號刺激后，NLRP3將與含CARD結構域的

4、凋亡相關顆粒樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1，caspase-1)組成炎癥復合體，促進caspase-1前體(pro-caspase-1)的自我剪切，形成具有活性的caspase-1p20/p10復合物，最終促進白介素1β(i

5、nterleukin1β，IL-1β)前體蛋白pro-IL-1β水解成具有活性的IL-1β。既往研究表明，IL-1β在心肌細胞凋亡中具有重要作用。
　　NLRP3炎癥小體的異常激活通常表現(xiàn)在兩個方面:一方面，NLRP3表達上調(diào);另一方面，NLRP3炎癥小體形成復合物，促進caspase-1及IL-1β等效應分子的產(chǎn)生。在巨噬細胞中，NF-kB可促進NLRP3表達上調(diào)。在HEK293T細胞中，TXNIP可促進NLRP3炎癥復合物的形

6、成，最終促進caspase-1及IL-1β等效應分子的產(chǎn)生。但是在高糖刺激的心肌細胞中，NF-kB及TXNIP是否與NLRP3炎癥小體的激活相關，目前尚未見報道。
　　近期研究顯示，caspase-1除了可以促進IL-1β成熟外，還可以促進細胞程序性死亡，這一過程被稱為“細胞焦亡(pyroptosis)”。細胞焦亡是一種與炎癥相關，依賴于caspase-1的程序性死亡方式。焦亡的細胞同時具備細胞凋亡及細胞壞死的部分形態(tài)特征。這主要

7、表現(xiàn)在:細胞焦亡存在DNA片段化損傷，并在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的粘性末端標記檢測(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)中呈現(xiàn)陽性;細胞焦亡時胞膜完整性消失，胞內(nèi)炎癥物質(zhì)會通過膜上的孔隙釋放到細胞間質(zhì)，胞外物質(zhì)會從孔隙滲入胞漿，促進細胞器及細胞漿腫脹，最終導致細胞破裂。因此，不能通過完整細胞膜而只能通過

8、形成孔隙的胞膜的染料可將活細胞與焦亡細胞區(qū)分開，如EthD-Ⅲ染料，它可將焦亡細胞染成陽性，但不能將正常細胞染色。焦亡現(xiàn)象最初是在巨噬細胞及樹突細胞等髓系細胞受到病原體刺激后觀察到的。近期研究顯示，一些非病原體也可刺激非髓系細胞出現(xiàn)焦亡現(xiàn)象。但是，高糖刺激的心肌細胞是否發(fā)生焦亡，目前未見報道。
　　在糖尿病小鼠及大鼠模型中，心肌組織的電鏡結果顯示大量心肌細胞呈現(xiàn)與焦亡細胞類似的形態(tài)特征，如線粒體腫脹空泡化、肌纖維紊亂溶解、細胞腫脹

9、、及細胞膜模糊不清等。此外，我們在預實驗中發(fā)現(xiàn)細胞焦亡關鍵因子caspase-1在DCM大鼠模型心肌組織中表達升高。據(jù)此，我們提出假設:糖尿病狀態(tài)下，心肌細胞ROS生成增多。ROS通過NF-kB及TXNIP促進NLRP3炎癥小體過度激活。NLRP3炎癥小體的異常激活通過促進心肌間質(zhì)炎癥反應、心肌細胞焦亡及心肌纖維化等途徑導致心臟結構和功能異常。
　　研究目的：
　　(1)建立2型DCM模型，探究NLRP3炎癥小體在DCM病程

10、不同階段的表達水平;
　　(2)利用NLRP3-miRNA慢病毒對DCM大鼠進行體內(nèi)干預，探究NLRP3炎癥小體在DCM中的作用;
　　(3)探究NLRP3炎癥小體影響DCM發(fā)生發(fā)展的相關機制。
　　研究方法：
　　2型糖尿病大鼠模型
　　將120只5周齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機分為4組（每組30只）:對照組（control組）、糖尿病組（DM組）、糖尿病+空載體慢病毒組（DM+ve

11、hicle組）及糖尿病+NLRP3-miRNA慢病毒組（DM+NLRP3-miRNA組）。Control組給予基礎飲食，主要成分為:5％脂質(zhì)，不添加膽固醇。其余3組給予高脂飲食喂養(yǎng)，主要成分為:16％脂質(zhì)及0.25％膽固醇。4周后4組大鼠均行腹腔葡萄糖耐量實驗(Intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)及腹腔胰島素耐量實驗(Intraperitoneal insulin tolerance

12、 test，IPITT)。DM組、DM+vehicle組及DM+NLRP3-miRNA組出現(xiàn)胰島素抵抗的大鼠接受單次腹腔STZ注射，劑量為35mg/kg。1周后，檢測4組大鼠的空腹血糖(BG)及胰島素(insulin，INS)，計算胰島素敏感指數(shù)(ISI)，ISI=In[(INS×BG)-1]。DM組、DM+vehicle組及DM+NLRP3-miRNA組大鼠連續(xù)兩次空腹血糖≥11.1mmol/L，且存在胰島素抵抗則認為2型糖尿病造模成

13、功。
　　糖尿病性心肌病模型
　　糖尿病大鼠造模成功后，繼續(xù)給予高脂喂養(yǎng)。至STZ注射后8周，檢測大鼠心功能，糖尿病大鼠出現(xiàn)左室舒張功能障礙則提示開始進展為DCM。至STZ注射后16周，檢測大鼠心臟結構及功能，糖尿病大鼠心臟組織呈現(xiàn)心肌間質(zhì)纖維化及左室肥厚的，并出現(xiàn)左室收縮及舒張功能障礙，則提示DCM模型已經(jīng)成功建立。
　　基因沉默技術
　　根據(jù)RNAi干擾技術的原則，設計4對針對大鼠NLRP3基因的miRNA片

14、段，并分別構建4對pcDNA6.2-GW/EmGFP-NLRP3-miRNA質(zhì)粒，經(jīng)篩選后，選擇沉默效率最高的質(zhì)粒，隨后構建pDONR221-EmGFP-NLRP3-miRNA重組穿梭質(zhì)粒，最終構建pLenti6.3—EmGFP-NLRP3-miRNA慢病毒載體。
　　慢病毒干預
　　在STZ腹腔注射8周后，分別給予DM+vehicle組及DM+NLRP3-miRNA組慢病毒空載體(vehicle)或NLRP3-miRNA慢

15、病毒(NLRP3-miRNA)干預8周。病毒干預8周后，對DM+vehicle組及DM+NLRP3-miRNA組全部大鼠實施安樂死，隨機抽取部分control及DM組大鼠（每組10只）實施安樂死。立即心臟取材，行冰凍切片檢測心肌病毒轉染效率。
　　NLRP3炎癥小體表達趨勢
　　Control組及DM組大鼠，分別在STZ注射后的第0、4、8、12、16及20周時取材，每組取3只，然后進行相關指標的檢測。
　　血清學檢測

16、
　　待實驗結束時，大鼠饑餓過夜，抽取外周靜脈血，分別檢測血清中血糖(bloodglucose)、甘油三酯(triglyceride，TG)及總膽固醇(totalcholesterol，TC)含量。
　　酶聯(lián)免疫吸附試驗(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISA)
　　利用ELISA測定大鼠外周血血清中胰島素的水平。
　　心臟彩超
　　大鼠經(jīng)10％水合氯醛麻醉后，行經(jīng)胸心臟彩

17、超，收集LVEDd、LVEF、F/S、E/A及E'/A'等數(shù)據(jù)評價大鼠左室功能。
　　組織學檢測
　　大鼠實施安樂死后，立即心臟取材，隨后稱重、測量心臟大小并留取圖像。于乳頭肌水平橫切心臟，制成石蠟切片，于乳頭肌平面連續(xù)切片，行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosinstaining，H&E)染色后留取圖像。
　　心肌纖維化
　　對左室心肌組織行Masson染色、天狼猩紅染色，使用圖像分析軟件對染色結果進

18、行分析，評價左室心肌纖維化程度。
　　透射電鏡
　　大鼠實施安樂死后，立即取出心臟，于左室壁取1mmβ小組織塊，立即放入戊二醛固定液中，為透射電鏡下觀察左室心肌超微結構做準備。
　　免疫組織化學
　　利用免疫組織化學的方法，觀察caspase-1及IL-1β在組織中的分布。
　　實時定量T-PCR
　　取新鮮左室心肌組織，利用實時定量RT-PCR的方法檢測大鼠左室心肌中NLRP3，ASC，caspas

19、e-1及IL-1βmRNA表達水平。
　　Westernblot
　　取新鮮左室心肌組織，利用Westemblot方法檢測大鼠左室心肌中TXNIP、NF-kB、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1及IL-1β的表達。
　　TUNEL檢測
　　利用TUNEL檢測大鼠左室組織中，心肌細胞核出現(xiàn)DNA損傷的情況。
　　細胞培養(yǎng)及干預
　　培養(yǎng)大鼠H9c2心肌細胞系，分為3組:基

20、礎糖培養(yǎng)組（control組）、中等濃度糖刺激組（medianglucose，MG組）及高濃度糖刺激組（highglucose，HG組）。在進行干預前，利用無血清基礎糖培養(yǎng)基進行饑餓處理。隨后給予含不同濃度葡萄糖的培養(yǎng)基進行不同時間梯度的干預。在ROS抑制實驗中，我們選擇N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)作為抑制劑對心肌細胞進行預處理。
　　心肌細胞病毒轉染
　　利用vehicle或NLRP3-mi

21、RNA慢病毒對心肌細胞進行干預，以探究NLRP3在心肌細胞中的作用及調(diào)控機制。
　　免疫熒光
　　利用免疫熒光技術觀察caspase-1在心肌細胞中的分布。
　　Caspase-1活性檢測
　　利用caspase-1活性檢測試劑盒檢測高糖刺激下caspase-1的活性。
　　ROS檢測
　　利用DCFH-DA檢測高糖刺激下心肌細胞ROS的產(chǎn)生。
　　細胞焦亡檢測
　　利用TUNEL檢測心肌

22、細胞核DNA損傷，利用EthD-Ⅲ染色檢測心肌細胞胞膜損傷，利用calcein-AM檢測細胞活性。
　　數(shù)據(jù)分析
　　利用SPSSv18.0處理數(shù)據(jù)，連續(xù)變量以均數(shù)±標準誤來表示。利用單因素方差分析(one-wayANOVA)和Tukey-Kramerposthoc檢驗比較多組間的連續(xù)變量。利用獨立樣本t檢驗比較兩組間的連續(xù)變量。當p＜0.05時認為有統(tǒng)計學意義。
　　研究結果：
　　高脂飲食4周可誘導大鼠出現(xiàn)胰

23、島素抵抗
　　IPGTT結果顯示，與基礎飲食相比，高脂喂養(yǎng)大鼠4周后，在IPGTT的0min、30min、60min、120min時血糖值均明顯升高(p＜0.05～p＜0.01);血糖曲線下面積(AUC)明顯增大(p＜0.01)。IPITT實驗也呈現(xiàn)類似結果(p＜0.05～p＜0.01)。
　　NLRP3炎癥小體及IL-1β在糖尿病性心肌病中表達增高
　　與對照組相比，糖尿病大鼠在STZ注射后第4或第8周起即出現(xiàn)NLR

24、P3、ASC、caspase-1及IL-1β3表達升高(p＜0.01)。此外，NLRP3炎癥小體各組分及IL-1β的mRNA水平多在STZ注射后第8周時達到頂峰，并持續(xù)高表達至第20周(p＜0.01)。與control組相比，NLRP3、ASC、pro-caspase-1、活化的caspase-1（caspase-1p20）及活化的IL-1β(IL-1βp17)在DM組中表達升高，且多在STZ注射后第8周達到頂峰，并持續(xù)高表達至第20周

25、(p＜0.01)。
　　NLRP3基因沉默不能改善糖尿病引起的代謝異常
　　在DM組大鼠中，血糖、血脂及胰島素水平均顯著高于control組(p＜0.01)，胰島素敏感指數(shù)顯著低于control組(p＜0.01)。利用NLRP3-miRNA進行體內(nèi)干預后，并不能改善糖尿病引起的代謝異常。
　　基因干預能有效抑制心肌組織NLRP3表達
　　與vehicle干預組相比，NLRP3-miRNA干預后，心肌組織中NLRP

26、3的mRNA及蛋白水平明顯降低(p＜0.01)。此外，心肌組織中caspase-1和IL-1β的表達也明顯降低(p＜0.01)。免疫組化結果顯示，在糖尿病大鼠的心肌組織中，caspase-1主要分布在細胞核周圍，IL-1β主要呈彌散分布(p＜0.01)。
　　NLRP3基因沉默可改善DCM左室功能異常
　　與control組比較，DM組的LVEF、FS、E/A及E'/A'均降低(p＜0.01)，LVEDd增大(p＜0.01)

27、。將NLRP3基因沉默后，糖尿病引起的LVEF、FS、E/A及E'/A'降低均明顯增加(p＜0.05～p＜0.01)，LVEDd明顯降低(p＜0.01)。
　　NLRP3基因沉默改善DCM心肌重構
　　與control組比較，DM組心肌重構的特點是:心肌細胞DNA損傷增多，心肌細胞超微結構受損，1型及3型膠原表達增加，1型及3型膠原比例增高，間質(zhì)纖維化增多，心臟向心性肥厚，心身比增大等。
　　與vehicle組相比，N

28、LRP3基因沉默可明顯改善DCM心肌重構，主要表現(xiàn)為:心肌細胞DNA損傷減少，1型及3型膠原表達降低，1型及3型膠原比例降低，間質(zhì)纖維化減少，身心比降低等。
　　高糖刺激心肌細胞NLRP3炎癥小體及IL-1β表達增高
　　與control組相比，MG或HG刺激24至48小時，可引起H9c2心肌細胞NLRP3，ASC，caspase-1及IL-1β的mRNA表達升高，且此升高呈現(xiàn)糖濃度依賴性(p＜0.01)。MG或HG刺激心肌

29、細胞24至48小時，NLRP3炎癥小體各組分及IL-1βp17的表達較control組均升高(p＜0.01)。HG刺激時，NLRP3、ASC及IL-1βp17在36小時表達量最高，并持續(xù)到48小時(p＜0.05)。據(jù)此，在后續(xù)的實驗中，我們選擇HG為刺激條件，36小時為刺激時間。與基礎培養(yǎng)基相比，與MG、HG滲透壓匹配的甘露醇并不能引起NLRP3炎癥小體及IL-1β表達升高。
　　高糖刺激誘導H9c2細胞caspase-1表達升高

30、及細胞焦亡
　　與control及MG組比較，HG組中的caspase-1p20表達明顯增高(p＜0.05～p＜0.01)。免疫熒光結果顯示，MG及HG可促進caspase-1在心肌細胞胞質(zhì)中聚集，同時我們還發(fā)現(xiàn)，與control組相比，心肌細胞核DNA的損傷及心肌細胞膜的破壞隨著caspase-1表達升高而加重(p＜0.01)。
　　NLRP3在高糖引起的細胞焦亡中發(fā)揮重要的作用
　　我們利用NLRP3-miRNA抑

31、制心肌細胞內(nèi)NLRP3的表達，探究NLRP3在心肌焦亡中的作用。在確保病毒轉染效率達80％以上的前提下，NLRP3-miRNA能夠有效抑制靶基因mRNA及蛋白的表達(p＜0.01)。隨著NLRP3蛋白的抑制，高糖刺激下caspase-1及IL-1β的活性也明顯受到抑制(p＜0.05～p＜0.01)。與此同時，高糖刺激下心肌細胞核DNA損傷及細胞膜受損較之前有明顯的改善(p＜0.05)。
　　NF-kB及TXNIP在ROS刺激NLR

32、P3激活中發(fā)揮重要作用
　　與control組相比，MG及HG組H9c2細胞ROS生成增多(p＜0.01)。同時，MG及HG組NF-kBp65磷酸化及TXNIP表達較control組增多(p＜0.01)。利用NAC預處理細胞能夠明顯減少細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生(p＜0.01)。隨著ROS的生成減少，NF-kBp65磷酸化及TXNIP表達減少，同時NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspasep20及IL-1βp17的表達降

33、低(p＜0.01)。
　　研究結論：
　　(1)糖尿病狀態(tài)下，心肌細胞焦亡及心肌纖維化促進心臟結構和功能異常;
　　(2)在糖尿病早期，心肌組織NLRP3炎癥小體即表達升高;
　　(3)利用NLRP3-miRNA慢病毒實施體內(nèi)干預后，心肌組織NLRP3的表達被有效抑制;
　　(4)抑制心肌組織NLRP3表達后，糖尿病引起的心肌結構和功能的異常明顯改善;
　　(5)高糖刺激可誘導心肌細胞ROS生成增多，

34、ROS可促進NLRP3炎癥小體表達升高，增高的caspase-1可促進心肌細胞出現(xiàn)細胞焦亡的特征;
　　(6)NF-kB及TXNIP可能介導了ROS促進NLRP3炎癥小體表達增多。
　　第二部分：NLRP3炎癥小體介導瑞舒伐他汀改善糖尿病性心肌病左室重構的實驗研究
　　研究背景:
　　糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是以舒張功能顯著受損和收縮功能輕度下降為特征的心肌病變，是

35、糖尿病病人的主要死亡原因之一。既往研究表明，炎癥反應在DCM中發(fā)揮著重要作用。因此，對DCM中炎癥反應的相關調(diào)控機制進行深入研究并尋找相關治療策略具有重要意義。
　　促炎因子白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)在DCM的發(fā)病過程中起到非常重要的作用。既往研究表明，IL-1β的激活主要受炎癥小體（inflammasome）調(diào)控。炎癥小體是位于細胞內(nèi)的一種多聚蛋白復合體，其家族成員包括:NLRs(nucleotide

36、 binding oligomerization domain-like receptors)家族及AIM2(absent in melanoma 2)家族。NLRP3(NOD like receptor protein 3，NLRP3)是NLRs亞組中的一員。NLRP3炎癥小體由NLRP3，含CARD結構域的凋亡相關顆粒樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CAR

37、D，ASC)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartatespecific proteinase-1，caspase-1)組成。近來有研究表明，NLRP3炎癥小體在糖尿病、糖尿病腎病及糖尿病視網(wǎng)膜病變等疾病的炎癥反應中起到非常重要的作用。此外，在高糖誘導的氧化應激反應中，NLRP3炎癥小體通過與硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting/inhibiting protein，TXN

38、IP)直接結合而被激活，繼而促發(fā)下游的炎癥反應。我們前期的實驗結果表明，NLRP3炎癥小體通過促進炎癥反應、心肌損傷及心肌纖維化而加速DCM的發(fā)生和發(fā)展。既往研究表明絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPKs)在DCM的炎癥反應中發(fā)揮著重要作用。
　　瑞舒伐他汀是一種HMG-CoA還原酶抑制劑。研究顯示，瑞舒伐他汀除了具有調(diào)脂作用外，還具有抗炎、抗氧化及逆轉心肌重構的作用。在心肌

39、肥厚、心肌梗死及實驗性自身免疫性心肌炎的動物模型中，瑞舒伐他汀的心臟保護作用已經(jīng)得到證實。但是，具有抗炎作用的瑞舒伐他汀能否影響DCM中異常表達的NLRP3炎癥小體及MAPKs通路，目前尚未見報道。瑞舒伐他汀能否通過NLRP3炎癥小體及MAPKs通路改善心肌重構，目前尚未見報道。
　　據(jù)此，本課題擬構建DCM大鼠模型，并研究瑞舒伐他汀在DCM發(fā)生、發(fā)展中的作用，探討瑞舒伐他汀是否通過調(diào)控NLRP3炎癥小體及MAPKs通路發(fā)揮心肌保

40、護作用，進一步研究NLRP3炎癥小體在DCM中潛在臨床價值。
　　研究目的:
　　(1)建立DCM大鼠模型，探討RSV在DCM進展中的作用;
　　(2)探討NLRP3炎癥小體及MAPKs通路在RSV對DCM大鼠心肌保護過程中的作用;
　　(3)探討RSV抑制NLRP3炎癥小體的可能機制。
　　研究方法:
　　2型糖尿病大鼠模型
　　選擇105只健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠（山

41、東省中醫(yī)藥大學實驗動物中心），平均體重為100-120g。將大鼠隨機分為7組:對照組（control組），高脂飲食組（HF組），糖尿病組（DM組），高脂飲食+瑞舒伐他汀10mg/kg組(HF+RSV10mg/kg組)，高脂飲食+瑞舒伐他汀15mg/kg組（HF+RSV15mg/kg組），糖尿病+瑞舒伐他汀10mg/kg組(DM+RSV10mg/kg組)，糖尿病+瑞舒伐他汀15mg/kg組(DM+RSV15mg/kg組)。Control組

42、給予基礎飼料喂養(yǎng)，主要成分為:5％脂質(zhì)，不添加膽固醇。其余6組給予高脂飲食喂養(yǎng)，主要成分為:16％脂質(zhì)，0.25％膽固醇。4周后7組大鼠均行腹腔葡萄糖耐量實驗(IPGTT)及腹腔胰島素耐量實驗(IPITT)。DM組、DM+RSV10mg/kg組及DM+RSV15mg/kg組出現(xiàn)胰島素抵抗的大鼠接受單次腹腔STZ注射，劑量為35mg/kg。1周后，檢測DM組、DM+RSV10mg/kg組及DM+RSV15mg/kg組大鼠的空腹血糖(BG)

43、及胰島素(INS)，計算胰島素敏感指數(shù)(ISI)，ISI=In[(INS×BG)-1]。連續(xù)兩次空腹血糖≥11.1mmol/L，且存在胰島素抵抗則認為2型糖尿病造模成功。在行STZ腹腔注射8周后，HF+RSV10mg/kg組、HF+RSV15mg/kg、DM+RSV10mg/kg組及DM+RSV15mg/kg分別給予瑞舒伐他汀干預8周。瑞舒伐他汀干預8周后，7組大鼠均實施安樂死。
　　糖尿病性心肌病模型
　　糖尿病大鼠造模成

44、功后，繼續(xù)給予高脂喂養(yǎng)。至STZ注射后8周，檢測大鼠心功能，糖尿病大鼠出現(xiàn)左室舒張功能障礙則提示開始進展為DCM。至STZ注射后16周，檢測大鼠心臟結構及功能，糖尿病大鼠心臟組織呈現(xiàn)心肌間質(zhì)纖維化及左室肥厚的，并出現(xiàn)左室收縮及舒張功能障礙，則提示DCM模型已經(jīng)成功建立。
　　基因沉默技術
　　根據(jù)RNAi干擾技術的原則，設計4對針對大鼠NLRP3基因的miRNA片段，并分別構建4對pcDNA6.2-GW/EmGFP-NLRP

45、3-miRNA質(zhì)粒，經(jīng)篩選后，選擇沉默效率最高的質(zhì)粒，隨后構建pDONR221-EmGFP-NLRP3-miRNA重組穿梭質(zhì)粒，最終構建pLenti6.3-EmGFP-NLRP3-miRNA慢病毒載體。
　　大鼠體內(nèi)轉染慢病毒載體
　　選擇90只健康雄性SD大鼠（山東省中醫(yī)藥大學實驗動物中心），平均體重為100-120g。將大鼠隨機分為6組:對照組+空載體組（control+vehicle組），糖尿病組+空載體組（DM+ve

46、hicle組），糖尿病+瑞舒伐他汀15mg/kg+空載體組(DM+RSV15mg/kg+vehicle組)，對照組+NLRP3-miRNA慢病毒干擾組（control+NLRP3-miRNA組），糖尿病組+NLRP3-miRNA慢病毒干擾組(DM+NLRP3-miRNA組)，糖尿病+瑞舒伐他汀15mg/kg+NLRP3-miRNA慢病毒干擾組(DM+RSV15mg/kg+NLRP3-miRNA組)。于STZ注射8周后，分別給予6組大鼠v

47、ehicle或NLRP3-miRNA慢病毒行體內(nèi)干預，同時還需給予DM+RSV15mg/kg+vehicle組及DM+RSV15mg/kg+NLRP3-miRNA組大鼠瑞舒伐他汀干預，慢病毒及瑞舒伐他汀的干預時間均為8周，慢病毒注射劑量為1×108TU/只。干預8周后給予大鼠安樂死，心臟取材后行冰凍切片，檢測心肌內(nèi)病毒轉染效率。
　　血清學指標檢測
　　于實驗結束時，行血清學檢測。大鼠禁食禁水12小時后，取外周靜脈血。檢測血

48、糖(bloodglucose，BG)、血清甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(totalcholesterol，TC)、胰島素(INS)，并計算胰島素敏感指數(shù)(ISI)。
　　心臟彩超
　　大鼠經(jīng)10％水合氯醛麻醉后，行經(jīng)胸心臟彩超，收集LVEF、F/S、E/A以及E'/A'等數(shù)據(jù)評價大鼠左室功能。
　　心肌纖維化
　　對左室心肌組織行Masson染色、天狼猩紅染色，使用圖像分析軟件對染色結果進

49、行分析，評價左室心肌纖維化程度。
　　透射電鏡
　　大鼠行安樂死后，立即心臟取材，于左室壁上取1mm3小組織塊，立即放入戊二醛固定液中，為透射電鏡下觀察左室心肌超微結構做準備。
　　實時定量PCR
　　取新鮮左室心肌組織，通過實時定量熒光PCR技術檢測TXNIP、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、collagenⅠ及collagenⅢ的mRNA相對表達量。
　　Westernblot檢測<

50、br>　　取新鮮左室心肌組織，提取蛋白，利用Westernblot檢測心肌組織內(nèi)TXNIIP、NLRP3、ASC、活化與非活化的caspase-1、活化的IL-1β及磷酸化和非磷酸化的ERK1/2、p38、JNK的蛋白表達量。
　　統(tǒng)計學分析
　　利用SPSSv18.0處理數(shù)據(jù)，連續(xù)變量以均數(shù)±標準誤來表示。利用單因素方差分析和Tukey-Kramerposthoc檢驗比較多組間的連續(xù)型變量。利用獨立樣本t檢驗比較兩組間的連

51、續(xù)變量。當p＜0.05時認為有統(tǒng)計學意義。
　　研究結果:
　　高脂飲食4周可誘導大鼠出現(xiàn)胰島素抵抗
　　IPGTT結果顯示，與基礎飲食相比，高脂喂養(yǎng)大鼠4周后，在IPGTT的0min、30min、60min、120min的血糖值均明顯升高(p＜0.05～p＜0.01);血糖曲線下面積(AUC)明顯增大(p＜0.01)。IPITT的結果顯示，與基礎飲食相比，高脂喂養(yǎng)大鼠4周后，在IPITT的0min、30min、60m

52、in、120min的血糖值均明顯升高(p＜0.05～p＜0.01);血糖曲線下面積(AUC)明顯增大(p＜0.01)。
　　瑞舒伐他汀對糖尿病大鼠血糖及胰島素水平無明顯影響
　　與Control及HF組大鼠相比，DM組大鼠表現(xiàn)出高血糖、高血脂、低胰島素水平及胰島素敏感性指數(shù)下降等特點(p＜0.01)。與Control組比較，HF也存在代謝異常的情況(p＜0.05～p＜0.01)。
　　與未治療組相比，10mg/kg及1

53、5mg/kg瑞舒伐他汀均能降低DM及HF組的膽固醇水平(p＜0.05)，且15mg/kg瑞舒伐他汀降脂效果優(yōu)于10mg/kg(p＜0.05)。與未用藥組相比，10mg/kg或15mg/kg的瑞舒伐他汀均未能逆轉DM組及HF組出現(xiàn)的血糖、甘油三酯及胰島素異常。
　　瑞舒伐他汀改善糖尿病引起的左室功能異常
　　DM組的LVEF、FS、E/A及E'/A'均低于Control組，HF組的E/A及E'/A'均低于Control組(p＜

54、0.05～p＜0.01)。
　　與未治療組相比，15mg/kg瑞舒伐他汀可以提高DM組的LVEF、E/A及E'/A'(p＜0.05)。10mg/kg瑞舒伐他汀可提高DM組的E'/A'(p＜0.05)。
　　瑞舒伐他汀改善糖尿病引起的心肌重構
　　與Control組相比，DM組及HF組的心身比(heartweighttobodyweight，HW/BW)均增加(p＜0.05～p＜0.01)。糖尿病誘導心肌間質(zhì)纖維化，促進

55、膠原Ⅰ及膠原Ⅲ的mRNA表達增加，促進膠原Ⅰ/Ⅲ的增大。與Control組相比，HF組也呈現(xiàn)心肌纖維化增多、膠原mRNA表達增加的現(xiàn)象(p＜0.05～p＜0.01)。Control組大鼠左室心肌組織透射電鏡結果顯示:心肌纖維成對稱性分布，Z線有序排列在肌節(jié)周圍，線粒體規(guī)則分布在肌纖維附近。DM組電鏡結果顯示:心肌超微結構混亂無序，部分區(qū)域心肌纖維溶解，Z線退化，線粒體腫脹并出現(xiàn)空泡化，線粒體聚集、融合、內(nèi)部線粒體嵴混亂。HF組電鏡結果顯

56、示左室心肌組織超微結構亦出現(xiàn)破壞，但破壞程度較DM組輕。
　　與未治療組相比，15mg/kg瑞舒伐他汀可降低DM組的HW/BW、左室纖維化面積、膠原Ⅰ/Ⅲ的表達量及比例的異常(p＜0.01)。10mg/kg瑞舒伐他汀僅能改善心肌纖維化及膠原Ⅰ的表達異常(p＜0.05～p＜0.01)。但與未治療組相比，瑞舒伐他汀未能有效改善HF組HW/BW及膠原Ⅰ及Ⅲ的表達量及比例異常。電鏡結果顯示，經(jīng)瑞舒伐他汀干預后，DM組及HF組的左心室心肌組

57、織超微結構較未治療組有明顯改善。
　　瑞舒伐他汀抑制炎癥小體激活
　　我們檢測不同組別大鼠左室心肌組織中TXNIP、NLRP3、ASC、未活化及活化的caspase-1(pro-caspase-1，caspase-1p20)及IL-1β(IL-1β，IL-1βp17)的mRNA及蛋白的表達水平。DM組中TXNIP、NLRP3、ASC、caspase-1及IL-1β的mRNA表達水平均高于control組(p＜0.01)。DM

58、組TXNIP、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1p20及IL-1βp17蛋白表達水平均高于control組(p＜0.05～p＜0.01)。與control組相比，HF組的TXNIP、NLRP3炎癥小體及IL-1β的mRNA及蛋白表達量明顯增高(p＜0.05～p＜0.01)。
　　與未治療組比較，15mg/kg瑞舒伐他汀可降低糖尿病引起的TXNIP、NLRP3炎癥小體及IL-1β的mRNA表達(p＜0

59、.05～p＜0.01)。10mg/kg瑞舒伐他汀也可明顯降低TXNIP及IL-1β的mRNA表達水平。與未治療組比較，瑞舒伐他汀降低了HF組TXNIP、NLRP3、ASC及IL-1β的mRNA表達水平(p＜0.05～p＜0.01)。與未治療組相比，15mg/kg瑞舒伐他汀降低糖尿病引起的TXNIP、NLRP3炎癥小體、IL-1βp17蛋白表達升高(p＜0.05～p＜0.01)。10mg/kg瑞舒伐他汀只降低糖尿病引起的pro-caspa

60、se-1蛋白表達升高(p＜0.05)。此外，15mg/kg瑞舒伐他汀的對TXNIP、ASC、pro-caspase-1、caspase-1p20及IL-1βp17蛋白表達的抑制效果優(yōu)于10mg/kg(p＜0.01)。對HF組進行相同干預，觀察到類似結果。
　　瑞舒伐他汀抑制MAPK信號通路
　　我們檢測不同組別大鼠左室心肌組織中磷酸化及未磷酸化的ERK1/2，p38及JNK的表達水平。與對照組相比，DM及HF組中磷酸化的ER

61、K1/2，p38及JNK表達升高(p＜0.05～p＜0.01)。與未治療組比較，10mg/kg及15mg/kg均能降低DM組磷酸化的ERK1/2，p38及JNK(p＜0.05～p＜0.01)。此外，15mg/kg瑞舒伐他汀抑制磷酸化的ERK1/2的作用優(yōu)于10mg/kg瑞舒伐他汀。在瑞舒伐他汀干預的HF組中也發(fā)現(xiàn)了類似結果(p＜0.05～p＜0.01)。
　　檢測體內(nèi)轉染后NLRP3沉默效率
　　行NLRP3-miRNA慢病

62、毒體內(nèi)轉染8周后，檢測心肌組織轉染效率。與轉染空載體組相比，轉染NLRP3-miRNA慢病毒組可明顯抑制大鼠心肌組織中NLRP3的mRNA及蛋白水平的表達。此外，隨著NLRP3表達的降低，IL-1βp17的表達也降低(p＜0.05～p＜0.01)。
　　瑞舒伐他汀通過抑制NLRP3改善糖尿病引起的心功能損害
　　進行8周的病毒干預后，與空載體組相比，NLRP3-miRNA干預組能顯著改善糖尿病引起的LVEF、FS、E/A及E

63、'/A'降低(p＜0.05)。此外，與空載體組相比，NLRP3-miRNA干預組能顯著提高DM+RSV15mg/kg組的E/A及E'/A'(p＜0.05)。
　　在空載體轉染的糖尿病大鼠中，給予瑞舒伐他汀干預能明顯改善心臟的收縮及舒張功能(p＜0.05)。但與空載體組相比，NLRP3-miRNA干預組中瑞舒伐他汀的這種心臟保護作用并不明顯。
　　瑞舒伐他汀通過抑制NLRP3減輕心肌損傷
　　與空載體組相比，NLRP3-

64、miRNA可以降低DM組的心身比、間質(zhì)纖維化、膠原Ⅰ及Ⅲ的mRNA表達及比例(p＜0.05～p＜0.01)。NLRP3-miRNA還能顯著改善心肌超微結構的損傷，包括逆轉降解的Z線、紊亂的心肌纖維、腫脹的線粒體及積聚的脂肪微粒。與空載體聯(lián)合15mg/kg瑞舒伐他汀相比，NLRP3-miRNA聯(lián)合15mg/kg瑞舒伐他汀能更顯著地改善糖尿病引起的心臟結構和功能的改變(p＜0.05～p＜0.01)。
　　瑞舒伐他汀的心肌保護作用在空載

65、體干預組中非常明顯，但這種保護作用在NLRP3-miRNA干預組中并不明顯。
　　研究結論:
　　(1)NLRP3炎癥小體介導了瑞舒伐他汀對DCM的心臟保護作用;MAPKs通路可能參與了瑞舒伐他汀對DCM的心臟保護作用;
　　(2)長期給予瑞舒伐他汀干預可劑量依賴性地改善糖尿病性心肌病左室重構及收縮和舒張功能障礙;
　　(3)瑞舒伐他汀的心肌保護作用包括:抑制心肌炎癥反應;減輕心肌細胞的肌纖維紊亂、Z線降解、線粒

66、體腫脹融合及脂質(zhì)沉積等超微結構的破壞;抑制膠原纖維的產(chǎn)生及沉積;
　　(4)TXNIP可能介導了瑞舒伐他汀抑制NLRP3炎癥小體的作用。
　　第三部分：原發(fā)性擴張型心肌病患者外周血NLRP3炎癥小體表達水平與預后的相關性研究
　　研究背景：
　　原發(fā)性擴張型心肌病(idiopathic dilated cardiomyopathy,IDCM)是一種病因不明，以心肌受累為基礎，以心室擴張及收縮功能受損為特點的疾病。

67、IDCM是繼冠狀動脈疾病及高血壓疾病之后，引起心功能衰竭的第三大常見疾病。臨床資料顯示，IDCM患者通常需要反復住院治療，部分患者預后不良。流行病學資料顯示，IDCM的治療已經(jīng)成為公共衛(wèi)生醫(yī)療系統(tǒng)的負擔。因此，尋找與IDCM預后相關、并能提供干預預警信號及臨床治療靶點的因子，已經(jīng)成為目前研究的熱點。
　　雖然IDCM的病因不明，但研究顯示病毒感染、炎癥、自身免疫異常及基因突變均能促進IDCM的發(fā)生及發(fā)展。其中，炎癥反應在IDCM的

68、病理生理過程中發(fā)揮重要作用。白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)是一種重要的促炎因子，其在多種心血管疾病中均表達上調(diào)。研究顯示，IL-1β的成熟主要受炎癥小體調(diào)控。炎癥小體是一種蛋白復合物，主要位于細胞質(zhì)內(nèi)，其家族成員主要包括NLRs（nucleotide binding oligomerization domain-like receptors）家族及AIM2(absent in melanoma 2)家族。NLRP

69、3(NOD like receptor protein 3)是NLRs亞組中的一員。NLRP3炎癥小體由NLRP3、含CARD結構域的凋亡相關顆粒樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containingCARD，ASC)及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1，caspase-1)組成。當NLRP3炎癥小體在

70、相關信號的刺激下形成復合物之后，pro-caspase-1將會自我剪切，最終具有活性的caspase-1p10/p20蛋白，活化的caspase-1又可促進IL-1β從非活性的前體pro-IL-1β轉化成具有活性的IL-β。
　　外周血單核淋巴細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)是血液循環(huán)中NLRP3炎癥小體的主要來源。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風濕性關節(jié)炎及系統(tǒng)性硬化等疾病中，PBMC

71、s中NLRP3炎癥小體的異常表達在疾病病程中起到重要的作用。近期的研究顯示，NLRP3炎癥小體在心肌缺血再灌注、急性心肌梗死及心衰等動物模型中表達上調(diào)，并促進心肌炎癥損傷及纖維化，最終導致心功能異常。我們的前期結果表明，NLRP3炎癥小體在糖尿病性心肌病中發(fā)揮重要作用。這些研究提示NLRP3炎癥小體的異常激活與心血管疾病密切相關，PBMCs中NLRP3炎癥小體的異常激活在疾病的發(fā)展過程中具有重大意義。但目前，IDCM患者PBMCs中NL

72、RP3炎癥小體的表達尚未見報道。
　　據(jù)此，本實驗將檢測IDCM患者PBMCs中NLRP3炎癥小體的表達水平，并探究IDCM患者體內(nèi)NLRP3炎癥小體表達水平與患者預后的相關性。
　　研究目的：
　　(1)探究NLRP3炎癥小體在IDCM患者PBMCs中的表達水平;
　　(2)探究NLRP3炎癥小體與IDCM患者臨床指標的相關性;
　　(3)探究NLRP3炎癥小體在IDCM患者預后評估中的價值。
　　

73、研究方法：
　　研究對象
　　連續(xù)收錄就診于山東大學齊魯醫(yī)院的IDCM患者54人（IDCM組），收錄健康志愿者20人（Control組）。IDCM患者同時患有以下疾病者不能納入實驗:活動期的心肌炎、冠脈疾病、心臟瓣膜病、高血壓、急性或慢性炎癥性疾病、糖尿病、甲狀腺功能異常、痛風及類風濕性關節(jié)炎。在患者入院及健康志愿者入組時開始收集臨床資料，主要包括:年齡、性別、血壓、12導聯(lián)心電圖(12-lead electrocardio

74、graphy，ECG)、心臟彩超檢查結果、紐約心功能分級(New York Heart Association，NYHA)、血常規(guī)檢查結果、血清N末端B型腦鈉肽(N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP)檢查結果等。IDCM患者住院期間均得到規(guī)范治療。本實驗設計已通過山東大學齊魯醫(yī)院倫理委員會審核。
　　PBMCs分離和純化
　　收集研究對象的外周血，并分離出血清及

75、PBMCs，分別存于-80℃?zhèn)溆谩?br>　　實時定量PCR
　　利用實時定量方法檢測研究對象PBMCs中NLRP3、ASC、caspase-1及IL-1β的mRNA表達水平。
　　流式細胞術
　　分別利用固定劑和打孔劑處理PBMCs，隨后分別使用NLRP3特異性一抗及帶有FITC的二抗孵育PBMCs，處理完畢后利用流式細胞術檢測PBMCs胞漿中NLRP3的蛋白表達水平。
　　Western blot
　　

76、從研究對象PBMCs中提取蛋白，利用westernblot方法檢測ASC、pro-caspase-1及活化的caspase-1的蛋白表達。
　　酶聯(lián)免疫反應(Enzyme-linked immunosobent assay，ELISA)
　　利用ELISA檢測研究對象外周血血清中IL-1β的含量。
　　隨訪
　　IDCM患者從山東大學齊魯醫(yī)院出院后，將患者因心功能惡化而再入院定為終點事件，對患者進行為期6個月的隨

77、訪，并記錄IDCM患者的再入院的時間。
　　統(tǒng)計分析
　　SPSS18.0用于統(tǒng)計分析。PASS用于效能計算。連續(xù)變量以均數(shù)±標準差的形式表示，分類變量以百分數(shù)形式表示。t檢驗用于兩組連續(xù)變量間統(tǒng)計分析。方差分析用于多組連續(xù)變量間統(tǒng)計分析?？ǚ綑z驗用于分類變量統(tǒng)計分析。偏相關分析用于目標因子與臨床指標相關性的統(tǒng)計分析。Cox回歸分析用于IDCM患者6個月內(nèi)再入院的影響因素的統(tǒng)計分析。Kaplan-Meier法用于2組IDCM

78、患者6個月再入院率的統(tǒng)計分析，并繪制時間-效應曲線。Log-rank檢驗用于比較2組IDCM患者6個月再入院率的比較。雙側p＜0.05時認為有統(tǒng)計學意義。
　　研究結果：
　　研究對象基本信息
　　IDCM組及Control組的臨床資料如表1所示。在所研究的參數(shù)中，僅左室射血分數(shù)（left ventricular ejection farction，LVEF）(p＜0.001)、NT-proBNP(p＜0.001)及外

79、周血單核細胞計數(shù)(p=0.008)在IDCM組及control組中存在統(tǒng)計學差異。
　　NLRP3炎癥小體及IL-1β在IDCM患者PBMCs中表達上調(diào)
　　入院24小時內(nèi)，在未進行治療干預前，IDCM組PBMCs中NLRP3炎癥小體及IL-1βmRNA表達水平較control組明顯升高（3.50±2.02vs.0.90±0.27，3.54±1.90vs.0.80±0.22，3.82±2.79vs.0.88±0.11，3.9

80、6±2.21vs.0.73±0.25，p＜0.001)。在IDCM組中，出院時NLRP3、ASC、caspase-1及IL-1β的mRNA水平較入院時降低（1.74±1.20vs.3.50±2.02，1.81±1.17vs.3.54±1.90，2.19±1.53vs.3.82±2.79，2.20±1.23vs.3.96±2.21，p＜0.001），但仍高于control組（1.74±1.20vs.0.90±0.27，p＜0.05;1.8

81、1±1.17vs.0.80±0.22，p＜0.01;2.19±1.53vs.0.88±0.11,p＜0.01;2.20±1.23vs.0.73±0.25,p＜0.05)。
　　入院24小時內(nèi)，在未進行治療干預前，IDCM組PBMCs中NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1蛋白表達水平及血清中IL-1β蛋白表達水平較control組明顯升高(p＜0.01)。在IDCM組中，出院時NLRP3、ASC、cas

82、pase-1及IL-1β的蛋白水平較入院時均降低(p＜0.01)，但仍高于control組(p＜0.01)。在IDCM組中，PBMCs中pro-caspase-1蛋白表達在入院時和出院時的表達水平未見明顯差異。
　　IDCM患者NLRP3炎癥小體的表達水平與臨床參數(shù)相關
　　入院時，剔除了年齡、性別等影響因素后，IDCM組PBMCs中NLRP3的mRNA水平與LVEF（r=-0.520，p＜0.05）、單核細胞數(shù)(r=0.6

83、13，p＜0.05)及NT-proBNP水平(r=0.514，p＜0.05)相關。IDCM組PBMCs中ASC的mRNA水平僅與LVEF（r=-0.334，p＜0.05）及單核細胞數(shù)(r=0.592，p＜0.05)相關。
　　NLRP3mRNA表達水平是IDCM患者6個月內(nèi)再入院的獨立危險因素
　　將IDCM患者出院時的LVEF及NLRP3、ASC、pro-caspase-1及IL-1β的mRNA表達水平納入Cox多因素回歸

84、分析模型，結果顯示:LVEF(RR:0.001，95％置信區(qū)間:0.000-0.128，p＜0.001)，NLRP3mRNA水平(RR:1.643，95％置信區(qū)間:1.193-2.264，p=0.002)，IL-1βmRNA水平（RR:1.512，95％置信區(qū)間:1.131-2.031，p=0.032）是IDCM患者6個月內(nèi)再入院的獨立危險因素。
　　NLRP3mRNA表達水平與IDCM預后相關
　　在IDCM患者中，出院時