橘青霉甲基轉(zhuǎn)移酶基因llm3的克隆和功能分析.pdf

1、背景：絲狀真菌是天然產(chǎn)物的寶庫，從絲狀真菌中分離的次級代謝產(chǎn)物大約有1500多種，一半以上的次級代謝產(chǎn)物都具有抗菌，抗腫瘤等活性。青霉素、環(huán)孢菌素、頭孢菌素、辛伐他汀、多柔比星、阿維霉素等藥物均來自絲狀真菌。近年來研究表明，絲狀真菌基因組中大量次級代謝基因簇處于沉默狀態(tài)。在絲狀真菌中，次級代謝基因簇的轉(zhuǎn)錄和翻譯受到多種因子的調(diào)控，如全局性調(diào)控因子LaeA、途徑特異性調(diào)控因子（含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子）和表觀遺傳等。他們共同調(diào)控絲狀真菌

2、生長發(fā)育和次級代謝基因簇的表達(dá)。
　　全局性調(diào)控因子LaeA是2004年在構(gòu)巢曲霉中發(fā)現(xiàn)，它含有保守的甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合位點(diǎn)，且該保守位點(diǎn)和絲狀真菌生長發(fā)育密切相關(guān)，可以促進(jìn)基因簇的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而調(diào)節(jié)絲狀真菌次級代謝產(chǎn)物的合成。2008年在構(gòu)巢曲霉中發(fā)現(xiàn)LaeA可以和VeA/VelB在細(xì)胞核內(nèi)形成蛋白三聚體，調(diào)節(jié)構(gòu)巢曲霉的生長發(fā)育和次級代謝。2013年，在構(gòu)巢曲霉中，發(fā)現(xiàn)了LaeA同源的甲基轉(zhuǎn)移酶LlmF，位于細(xì)胞質(zhì)中，也可以和Ve

3、A/VelB在細(xì)胞質(zhì)中形成三聚體，調(diào)節(jié)次級代謝和生長發(fā)育。LaeA和LaeA類似的甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白成為研究熱點(diǎn)，研究方向更多的集中在甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白Llm調(diào)控絲狀真菌的全局網(wǎng)絡(luò)。
　　橘青霉是美伐他汀產(chǎn)生菌，目前對于橘青霉次級代謝和生長發(fā)育的研究還比較少，基因組數(shù)據(jù)分析顯示橘青霉中存在大量未知的次級代謝基因簇，其合成次級代謝的潛力還未被充分挖掘。本課題組已經(jīng)報道了全局性調(diào)控因子LaeA、VeA正向調(diào)節(jié)橘青霉美伐他汀的生物合成，基因組測

4、序獲得橘青霉基因組序列框架圖，但是在橘青霉中是否存在其他的甲基轉(zhuǎn)移酶以及這些蛋白是否參與橘青霉次級代謝和生長發(fā)育的調(diào)節(jié)還未見報道。本課題在獲得橘青霉基因組框架圖的基礎(chǔ)上，分析橘青霉基因組中潛在的甲基轉(zhuǎn)移酶，成功獲得9個含有AdoMet_MTases結(jié)構(gòu)域的蛋白，并重點(diǎn)分析了Llm3的功能。通過農(nóng)桿菌和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法獲得了橘青霉llm3過表達(dá)和敲除菌株，探索llm3對橘青霉生長發(fā)育和次級代謝合成的影響。
　　目的：利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)

5、的轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化構(gòu)建了橘青霉llm3過表達(dá)菌株（OE::llm3菌株）和llm3敲除菌株（Δllm3菌株），分析橘青霉OE::llm3菌株、Δllm3菌株和WT菌株之間菌落菌絲形態(tài)、孢子產(chǎn)量、美伐他汀產(chǎn)量等的差異，探究橘青霉中l(wèi)lm3對次級代謝和生長發(fā)育的影響。
　　方法：
　　1.提取橘青霉基因組，利用Illumina Hiseq測序技術(shù)，獲得橘青霉基因組框架圖；
　　2.通過本地blast獲得橘青霉中含有Ado

6、Met-MTases結(jié)構(gòu)域的蛋白，用進(jìn)化樹分析各蛋白之間同源關(guān)系，用RT-PCR獲得橘青霉llm3的cDNA序列，分析Llm3蛋白質(zhì)序列中的保守位點(diǎn)；
　　3.在pYEU和pGiHTGi載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建敲除和過表達(dá)載體，所構(gòu)建載體利用酶切和測序進(jìn)行驗(yàn)證。將驗(yàn)證好的過表達(dá)質(zhì)粒pGiHTGi-llm3轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中，通過潮霉素抗性篩選和PCR驗(yàn)證獲得橘青霉llm3過表達(dá)菌株。利用原生質(zhì)體將pYEU質(zhì)粒中6.1kb的敲除片段

7、轉(zhuǎn)入橘青霉中，利用潮霉素抗性初篩和PCR驗(yàn)證獲得敲除敲除菌株；
　　4.通過菌落培養(yǎng)、顯微鏡觀察和血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)分析WT菌株、OE::llm3菌株和Δllm3菌株在黑暗條件下的菌絲、菌落和孢子產(chǎn)量差異。利用RT-qPCR技術(shù)分析三株菌中孢子形成關(guān)鍵基因abaA和brlA的轉(zhuǎn)錄差異；
　　5.在PGA培養(yǎng)基中發(fā)酵WT菌株、OE::llm3菌株和Δllm3菌株，通過HPLC檢測三株菌的美伐他汀產(chǎn)量，利用RT-qPCR技術(shù)分析美伐

8、他汀合成基因簇中mlcR、mlcB的轉(zhuǎn)錄差異。
　　結(jié)果：
　　1.橘青霉基因組大小為31.34Mb，一共有716個contigs；
　　2.通過橘青霉本地blast，成功鑒定了橘青霉中9個甲基轉(zhuǎn)移酶，生物信息學(xué)分析Llm3的結(jié)構(gòu)和功能；
　　3.成功獲得了OE::llm3和Δllm3菌株。
　　4.llm3抑制橘青霉的無性繁殖。OE::llm3菌株的菌落顏色較淺，Δllm3菌株菌落顏色較深，OE::llm

9、3菌株孢子產(chǎn)量較WT菌株少，而Δllm3菌株孢子產(chǎn)量較WT菌株多。OE::llm3菌株中分生孢子發(fā)育相關(guān)基因abaA和brlA的表達(dá)量明顯降低，Δllm3菌株中分生孢子發(fā)育相關(guān)基因abaA和brlA的表達(dá)量顯著提高。
　　5.llm3調(diào)控美伐他汀生物合成。在發(fā)酵第四天，WT菌株美伐他汀產(chǎn)量達(dá)到最大值，隨后美伐他汀產(chǎn)量下降。而過表達(dá)llm3后，美伐他汀產(chǎn)量從第四天開始增加，且持續(xù)積累，一直到第八天，產(chǎn)量還處于上升趨勢，llm3敲除后

10、，美伐他汀產(chǎn)量和野生型趨勢相似，但是比野生型低。
　　結(jié)論：
　　在橘青霉中，llm3參與調(diào)節(jié)橘青霉的生長發(fā)育和次級代謝，llm3抑制橘青霉無性發(fā)育過程，且正向調(diào)控美伐他汀生物合成。一方面，Llm3通過抑制分生孢子合成途徑關(guān)鍵基因abaA和brlA的轉(zhuǎn)錄，從而抑制分生孢子的形成；另一方面，Llm3通過激活美伐他汀合成基因簇調(diào)控基因mlcR的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)合成基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。橘青霉中新的全局調(diào)控因子llm3對橘青霉生長發(fā)育和美伐他