液相色譜-多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜技術(shù)中一種新的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算方法及其在人肝微粒體藥物代謝酶中的應(yīng)用.pdf

1、在研究細(xì)胞、組織或體液中的蛋白質(zhì)組時(shí)，不僅需要對(duì)這些蛋白質(zhì)組進(jìn)行定性分析，更需要對(duì)其進(jìn)行定量分析。生物體中蛋白質(zhì)的絕對(duì)量以及量的變化對(duì)于揭示生物體的生理狀態(tài)及病理狀態(tài)具有重要意義，因此，目標(biāo)蛋白質(zhì)學(xué)已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)研究熱點(diǎn)。人肝微粒體中的CYP和UGT酶是藥物進(jìn)行代謝的主要酶類，其表達(dá)水平受到基因多態(tài)性的影響，存在著個(gè)體差異性。由于這些藥物代謝酶量的不同對(duì)藥物的生物利用度具有很大的影響，因此，對(duì)藥物代謝酶含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量不僅在要

2、去研發(fā)，而且在臨床應(yīng)用中具有重要意義。高效液相色譜-同位素稀釋法-多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜（HPLC-SID-MRM MS）方法因其高靈敏度、高選擇性、高準(zhǔn)確性和高通量的特點(diǎn)，加之不需要特異性抗體，已經(jīng)成為藥物代謝酶定量分析的常用方法，可同時(shí)對(duì)復(fù)雜生物樣本中多個(gè)蛋白進(jìn)行定量。但是，這種定量方法應(yīng)用于復(fù)雜生物樣本中多個(gè)蛋白定量時(shí)，存在空白樣本基體難以制備的問題，文獻(xiàn)中多采用基體緩沖液或外源性基體代替，這會(huì)使定量的準(zhǔn)確性變差，因此，實(shí)際樣本作為基體的

3、同位素稀釋法可有效解決空白基體的制備問題，但其中內(nèi)源分析物含量的計(jì)算一般采用單濃度點(diǎn)計(jì)算或不同濃度點(diǎn)計(jì)算后取平均值的方法，影響內(nèi)源分析物含量的準(zhǔn)確度，為此，我們提出一種建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方法計(jì)算內(nèi)源性分析物，即內(nèi)源性目標(biāo)肽段的計(jì)算方法，提高了定量方法的準(zhǔn)確性。將建立的定量方法應(yīng)用于20例人肝微粒體中的21種藥物代謝酶進(jìn)行了含量測(cè)定，揭示了正常中國(guó)人藥物代謝酶的含量范圍及不同酶之間的相關(guān)性關(guān)系，對(duì)藥物研發(fā)和臨床用藥具有一定的指導(dǎo)意義。

4、另外，高效液相色譜分離可降低復(fù)雜生物樣本的復(fù)雜度，有利于提高蛋白定量的準(zhǔn)確度，為此，制備了一種亞2μm反相色譜填料，并對(duì)其進(jìn)行了性能評(píng)價(jià)。
　　本論文共分為四個(gè)部分。第一章概述了定量蛋白質(zhì)學(xué)的研究意義及現(xiàn)狀以及高效液相色譜-多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜（SID-MRM MS）方法、內(nèi)標(biāo)肽段制備技術(shù)、人肝微粒體中藥物代謝酶定量方法以及亞2μm反相色譜填料制備技術(shù)的研究進(jìn)展，在此基礎(chǔ)上提出了本論文的研究?jī)?nèi)容和目標(biāo)。
　　在第二章中，提出了在應(yīng)

5、用同位素稀釋結(jié)合多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜(SID-MRMMS)技術(shù)進(jìn)行復(fù)雜生物樣本中蛋白質(zhì)定量中一種新的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算方法，并應(yīng)用于人肝微粒體藥物代謝酶的含量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與單濃度點(diǎn)計(jì)算方法比較，可提高定量的準(zhǔn)確度，即所建方法的回收率為97.0％、定量限LOQ為低于20 fmol、5次測(cè)量的變異系數(shù)低于10％、線性范圍為低于20fmol-1000 fmol。進(jìn)一步將此種方法應(yīng)用于5例人肝微粒體樣本中的21種藥物代謝酶含量的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)

6、道結(jié)果一致。
　　在第三章中，為了揭示正常中國(guó)人CYPs和UGTs的含量范圍及個(gè)體差異性，將建立的SID-MRM MS方法對(duì)20例正常中國(guó)人人肝微粒體中的21種藥物代謝酶進(jìn)行了準(zhǔn)確定量，并且統(tǒng)計(jì)分析了不同藥物代謝酶之間的含量相關(guān)性關(guān)系。其中個(gè)體差異性最大的藥物代謝酶是CYP3A4、CYP3A5和 UGT1A1;其中CYP3A4的個(gè)體差異性達(dá)129倍，CYP3A5的個(gè)體差異性達(dá)99倍，UGT1A1的個(gè)體差異性達(dá)到170倍;其次CYP

7、1A2、CYP2A6和UGT2B10的個(gè)體差異性達(dá)到幾十倍左右。藥物代謝酶表達(dá)水平的兩兩相關(guān)性通過非參數(shù)施佩爾曼秩檢驗(yàn)(Spearman rank test)進(jìn)行相關(guān)性分析(p=0.01)，分析結(jié)果顯示:CYP1A2、CYP2C8和CYP2C9酶表達(dá)水平具有兩兩正相關(guān)性，UGT1A6、UGT1A9、UGT2B4和UGT2B7酶的表達(dá)水平具有兩兩正相關(guān)性。
　　在第四章中，采用“點(diǎn)擊化學(xué)”的合成方法制備了亞2μm反相色譜填料，F(xiàn)T-