肝癌病人肝微粒體中CYP450酶代謝活性的改變.pdf

1、肝癌主要指肝細胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC），是我國常見的惡性腫瘤之一，它具有惡性度高、侵襲性強、進展快、預后差和死亡率高等特點。細胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP）是一類位于內質網(wǎng)的亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白超家族，參與多種內源性物質和外源性化合物的代謝。亞硝胺類、黃曲霉毒素、煙草和酒精等已被證實為肝癌風險因素，這些致癌物質在體內的轉化代謝均有CYP酶參與。因此，深入研究CYP

2、酶活性與肝癌的相關性是當今世界研究的重要課題。
　　為了考察肝癌病人藥物代謝的變化，支持臨床合理用藥，本課題以102例HCC病人非腫瘤肝組織為研究對象，105例正常非腫瘤肝組織為對照，系統(tǒng)地了考察了10種主要CYP酶（CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4/5）對探針藥物的體外代謝活性；測定了肝微粒體蛋白含量；分析了肝纖維化程度和基因多態(tài)性對C

3、YP酶活性的影響，以期發(fā)現(xiàn)肝癌病人藥物代謝的個體差異及影響因素，為臨床個體化用藥提供理論依據(jù)。
　　方法
　　1.倫理學聲明
　　本研究方案經(jīng)鄭州大學倫理委員會批準，受試者均已簽署知情同意書。
　　2.肝臟標本
　　本研究收集的人肝標本均為常規(guī)手術切除的非腫瘤肝臟組織，標本來自河南省人民醫(yī)院和河南省腫瘤醫(yī)院。102例HCC病人，伴有HBV或HCV感染，肝標本經(jīng)組織病理學證實伴有肝硬化或肝纖維化病變。105例

4、對照組肝標本來自肝血管瘤、肝轉移癌、膽石癥和膽囊癌病人，肝功能正常，無HBV或HCV感染，經(jīng)組織病理學證實肝標本為正常肝組織。所有肝標本在手術切除后經(jīng)常規(guī)處理，于30分鐘內置于液氮以備后期使用。
　　HCC組中男性86例、女性16例，年齡范圍29歲～75歲（53±11歲），吸煙者45例（占44.1％），飲酒者37例（占36.3%）。對照組中男性37例、女性68例，年齡范圍20歲～75歲（48±10歲），吸煙者12例（占11.9%）

5、，飲酒者12例（占11.9%）。受試者均常規(guī)使用麻醉藥，用藥史顯示近期未使用CYP酶誘導劑或抑制劑。
　　肝組織經(jīng)過固定、包埋、HE和Masson染色，根據(jù)Scheuer分級標準，按纖維化程度分為S1～S4期。其中，S1～S3期病變程度較輕，為肝纖維化；S4期病變程度較重為肝硬化。
　　3.肝微粒體制備及蛋白測定
　　采用低溫差速離心法制備人肝微粒體（human liver microsomes，HLMs）；肝微粒體蛋

6、白濃度采用Bradford法測定；一氧化碳差示法測定總CYP含量和細胞色素b5（cytochrome b5，Cyt b5）含量；根據(jù)細胞色素c電子受體測定NADPH-P450還原酶（POR）活性；肝臟回收率為相同個體的肝微粒體POR活性與肝勻漿POR活性之比；每克肝臟的微粒體蛋白含量（value of microsomal protein per gram of liver，MPPGL）以肝微粒體濃度×體積/肝標本凈重/肝臟回收率計算得

7、到。
　　4.基因分型
　　本研究檢測了在中國人群中發(fā)生頻率超過1%的多態(tài)性位點，包括CYP酶的24個突變位點、以及POR的16個突變位點。其中CYP2E1*1C*1D基因型采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）的一步PCR方法，通過測定產(chǎn)物片段長度確定。其余基因突變位點均采用質譜方法檢測，通過檢測兩個不同突變所引起的單堿基延伸產(chǎn)物分子量的差異確定。
　　5.10種CYP酶對探針

8、底物的代謝活性
　　采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）-紫外法（UV）或熒光法（FLD）測定探針底物的代謝產(chǎn)物濃度。非那西丁、香豆素、安非他酮、紫杉醇、甲苯磺丁脲、奧美拉唑、右美沙芬、氯唑沙宗和咪達唑侖分別作為CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4/5的體外探針，底物的生物

9、轉化程度（TR）作為反應速度，GraphPad Prism5.0軟件計算米氏常數(shù)（Km）和最大反應速度（Vmax），體外代謝內在清除率（CLint）由Vmax/Km比值得到。所建立的藥物測定方法均在一定范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系（r>0.999）；日內、日間變異均<15%；相對回收率均在85%～115%之間；底物穩(wěn)定性良好，所建立的分析方法符合生物樣本的測定要求。
　　探針底物范圍如下：非那西丁6.25～800μM，香豆素0.156

10、～20μM，安非他酮7.8～500μM，紫杉醇2.5～80μM，甲苯磺丁脲31.25～2000μM，奧美拉唑3.9～500μM，右美沙芬2.5～640μM，氯唑沙宗7.8～500μM，咪達唑侖0.39～50μM。體系微粒體蛋白濃度為：CYP1A2、CYP2A6和CYP2E1均為0.3 mg·ml-1；CYP2D6和CYP3A4/5為0.2 mg·ml-1；CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9和CYP2C19為0.5 mg·ml-1。

11、預孵育時間均為37℃水浴5 min，孵育時間為CYP1A2、CYP2A6和CYP2E1均為30 min；CYP2B6和CYP2C9為60 min；CYP2C19為90 min；CYP2C8為120 min；CYP2D6為20 min；CYP3A4/5為5 min。孵育結束時加入20μl冰乙腈或10μl高氯酸沉淀或1 ml乙酸乙酯萃取終止反應。
　　6.統(tǒng)計學分析
　　正態(tài)性檢驗結果表明，人肝微粒體代謝底物的酶動力學參數(shù)呈非正

12、態(tài)分布，故采用非參數(shù)檢驗進行數(shù)據(jù)分析。SPSS17.0對各項數(shù)據(jù)資料進行統(tǒng)計學分析，兩組間參數(shù)比較采用兩個獨立樣本檢驗，兩組間等位基因分布比較采用卡方檢驗，檢驗水準α為0.05。
　　結果
　　1.肝臟標本的組織病理分級
　　102例HCC肝標本中，S1～S4期分別有8、19、27、48例；其中有54例為肝纖維化（S1、S2、S3），48例為肝硬化（S4）。
　　2.肝微粒體蛋白含量
　　結果顯示，102例

13、HCC肝微粒體的總CYP含量、細胞色素b5含量、MPPGL的中位數(shù)（范圍）分別為134.0（33.5～468.9）pmol·mg-1、293.2（109.7～506.3） pmol·mg-1和28.9（7.7～93.6） mg·g-1，POR活性為44.6（17.8～74.3） pmol·min-1·mg-1。
　　與對照組相比，HCC肝微粒體總CYP含量、MPPGL、POR活性均顯著性降低。
　　3.10種CYP酶的代謝活

14、性
　　3.1肝微粒體水平的酶活性
　　以每毫克肝微粒體蛋白為單位，CYP酶對探針底物的清除率代表肝微粒體水平的酶活性。HCC病人10種CYP的酶動力學參數(shù)（Km、Vmax和CLint）中位數(shù)（范圍）分別為：CYP1A2為70.0（33.2～687.8）μM、521.5（68.6～2605.0） pmol·min-1·mg-1及7.8（0.29～42.8）μl·min-1·mg-1，個體差異為20～147倍。CYP2A6為3

15、.6（0.58～17.6）μM、522.8（0.73～2880.0）pmol·min-1·mg-1及145.4（0.26～260.0）μl·min-1·mg-1，個體差異為30～3945倍。CYP2B6為108.7（46.9～1198.0）μM、78.0（15.0～237.9）pmol·min-1·mg-1及0.71（0.049～4.5）μl·min-1·mg-1，個體差異為15～91倍。CYP2C8為23.4（9.5～235.5）μM

16、、13.5（4.7～112.3） pmol·min-1·mg-1及0.63（0.035～4.0）μl·min-1·mg-1，個體差異為23～114倍。CYP2C9為204.6（60.1～773.1）μM、319.1（61.9～903.2）pmol·min-1·mg-1及1.5（0.08～4.5）μl·min-1·mg-1，個體差異為12～56倍。CYP2C19為71.6（28.8～275.5）μM、101.8（21.5～268.4）pm

17、ol·min-1·mg-1及1.4（0.22～3.9）μl·min-1·mg-1，個體差異為9～17倍。CYP2D6為30.7（7.8～273.5）μM、172.4（37.8～560.4） pmol·min-1·mg-1及6.9（0.49～54.7）μl·min-1·mg-1，個體差異為14～111倍。CYP2E1為60.3（24.3～91.3）μM、1238.0（151.0～4858.0）pmol·min-1·mg-1及20.9（4.

18、1～53.2）μl·min-1·mg-1，個體差異為3～32倍。CYP3A4/5為2.6（1.1～8.0）μM、1205.5（332.4～4602.0）pmol·min-1·mg-1及524.8（73.8～1099.8）μl·min-1·mg-1，個體差異為7～14倍。
　　與對照組相比，對于Km，HCC組中CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C19、CYP2E1和CYP3A4/5的Km均明顯升高。對于

19、 Vmax，CYP2A6、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4/5的值均升高，其中CYP2E1的Vmax增加了2.3倍；CYP1A2和CYP2C8的Vmax顯著下降。對于CLint，CYP2C9、CYP2D6和CYP2E1的值顯著升高、CYP1A2、CYP2C8和CYP2C19的CLint降低。其中CYP2C8的CLint下降尤為顯著，比對照組降低了77%。
　　3.2肝組織水平的酶活性
　　

20、以每克肝臟為單位，CYP酶對探針的清除率代表肝組織水平的酶活性。根據(jù)肝組織的MPPGL含量，由微粒體水平酶活性推導出肝組織水平的酶活性。HCC組10種CYP酶的Vmax和CLint中位數(shù)（范圍）分別為：CYP1A2為13551.5（1110.7～158520.7）pmol·min-1·g-1及199.6（13.5～2436.9）μl·min-1·g-1。CYP2A6為14988.9（18.4～114723.7）pmol·min-1·g-

21、1及3760.4（8.2～13285.9）μl·min-1·g-1。CYP2B6為2159.1（286.6～14008.3） pmol·min-1·g-1及19.7（0.63～98.9）μl·min-1·g-1。CYP2C8為408.4（63.0～2915.4）pmol·min-1·g-1及17.4（0.80～149.4）μl·min-1·g-1。CYP2C9為9037.1（816.2～37935.6）pmol·min-1·g-1及43

22、.6（3.0～178.9）μl·min-1·g-1。CYP2C19為2816.3（260.3～11678.2）pmol·min-1·g-1及39.1（1.7～127.3）μl·min-1·g-1。CYP2D6為5300.4（332.3～28727.7）pmol·min-1·g-1及191.0（4.6～1711.0）μl·min-1·g-1。CYP2E1為34690.2（1155.1～113794.2） pmol·min-1·g-1及60

23、4.6（31.1～2024.8）μl·min-1·g-1。CYP3A4/5為31264.6（2666.7～143812.5）pmol·min-1·g-1及14644.2（1167.6～51938.0）μl·min-1·g-1。
　　HCC組與對照組相比，對于Vmax，CYP1A2、CYP2C8和CYP2C19的Vmax均降低，CYP2E1的Vmax升高。對于Clint，CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP

24、2C19和CYP3A4/5的Clint均比對照組降低，CYP2E1的Clint增加。
　　3.3 CYP水平的酶活性
　　以每pmol CYP亞型為單位，CYP酶對探針的清除率代表CYP水平的酶活性。根據(jù)肝臟微粒體總CYP含量，由微粒體水平活性推導出CYP水平的酶活性。HCC組10種CYP酶的Vmax和CLint中位數(shù)（范圍）分別為：CYP1A2為3.9（0.30～31.3）pmol·min-1·pmol-1及0.06（0.

25、002～0.52）μl·min-1·pmol-1。CYP2A6為3.7（0.004～43.0）pmol·min-1·pmol-1及0.90（0.002～4.2）μl·min-1·pmol-1。CYP2B6為0.58（0.03～3.3）pmol·min-1·pmol-1及0.005（0.0003～0.03）μl·min-1·pmol-1。CYP2C8為0.10（0.02～0.83） pmol·min-1·pmol-1及0.005（0.00

26、01～0.04）μl·min-1·pmol-1。CYP2C9為2.3（0.33～12.5）pmol·min-1·pmol-1及0.01（0.001～0.08）μl·min-1·pmol-1。CYP2C19為0.62（0.046～3.6）pmol·min-1·pmol-1及0.0099（0.00099～0.05）μl·min-1·pmol-1。CYP2D6為1.2（0.14～7.7）pmol·min-1·pmol-1及0.044（0.00

27、1～0.49）μl·min-1·pmol-1。CYP2E1為8.3（1.1～48.4） pmol·min-1·pmol-1及0.15（0.023～0.67）μl·min-1·pmol-1。CYP3A4/5為9.1（1.1～57.6）pmol·min-1·pmol-1及3.5（0.49～13.5）μl·min-1·pmol-1。
　　與對照組相比，HCC組中CYP2C8的Vmax顯著降低，CYP2A6、CYP2B6、CYP2C9、C

28、YP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4/5的Vmax均升高。對于CLint，CYP1A2和CYP2C8的Vmax均降低，CYP2A6、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4/5的CLint均升高。
　　4. CYP等位基因頻率的分布
　　對比HCC組和對照組，CYP2D6*10（100C>T）等位基因頻率分布存在顯著性差異。CYP2D6*10突變純合子TT在HCC組的頻率明顯降低

29、（16.7%vs.46.7%，P<0.01），而雜合子CT頻率顯著增加（46.9%vs.21.9%，P<0.01）。在HCC組內等位基因頻率高低依照CT>CC>TT排次，而在對照組則相反，為TT>CC>CT。
　　兩個亞組（纖維化組和肝硬化組）分別與對照組相比，CYP2D6*10等位基因分布也存在顯著差異。在纖維化組和肝硬化組中突變純合子TT頻率均比對照組顯著降低，而雜合子CT頻率顯著升高。
　　纖維化組與肝硬化組相比，CY

30、P2D6*10等位基因頻率存在顯著差異，肝硬化組中突變純合子TT頻率比纖維化組顯著降低（8.9%vs.23.9%，P<0.01）。
　　5. CYP基因多態(tài)性對酶活性的影響
　　結果顯示在HCC組中，4種CYP基因多態(tài)性對酶活性產(chǎn)生影響。對于Km，CYP2D6*10（100C>T）的突變純合子TT（125.1μM）、雜合子CT（30.4μM）分別與野生型CC（17.4μM）相比，Km均顯著升高。Vmax的趨勢與Km相反，TT

31、（89.4 pmol·min-1·mg-1）及CT（155.6 pmol·min-1·mg-1）攜帶者均顯著低于CC攜帶者的Vmax（241.5 pmol·min-1·mg-1）。對于CLint，TT（0.70μl·min-1·mg-1）、CT（6.9μl·min-1·mg-1）與CC（13.2μl·min-1·mg-1）相比，CLint均明顯降低，其中較為顯著的變化是TT攜帶者與CC攜帶者相比CLint降低了95%。
　　CYP

32、3A5*3突變純合子*3*3的Km（2.3μM）、雜合子*1*3的Km（2.8μM）與野生型*1*1（3.9μM）相比，均顯著降低。Vmax顯示出與 Km相同的趨勢（*3*3<*1*3<*1*1）。對于 CLint，*3*3（490.8μl·min-1·mg-1）、*1*3（542.0μl·min-1·mg-1）與*1*1（762.9μl·min-1·mg-1）相比，CLint均顯著性降低。
　　在 HCC病人中未檢測到 CYP2

33、C9*3突變純合子*3*3基因型。雜合子*1*3比野生型*1*1的Vmax顯著性降低（223.2 vs.326.5 pmol·min-1·mg-1，P<0.01）。同時，*1*3攜帶者（1.1μl·min-1·mg-1）比*1*1攜帶者的CLint（1.6μl·min-1·mg-1）顯著降低（P<0.05）。
　　CYP2B6（516G>T）突變純合子TT的CLint和Vmax均低于野生型GG的CLint和Vmax。
　　在

34、對照組中，CYP2D6*10、CYP3A5*3及CYP2C9*3等三種基因突變對酶活性的影響較為顯著，均引起CYP酶活性下降。
　　HCC組與對照組相比，基因多態(tài)性對酶活性的影響基本一致，即CYP2D6*10、CYP3A5*3及CYP2C9*3等三種突變對酶活性具有顯著的影響，突變均導致CYP酶代謝能力下降。
　　6. POR基因多態(tài)性對CYP酶活性的影響
　　以 CLint代表 CYP酶活性，在 HCC組中 POR基

35、因多態(tài)性對 CYP1A2、CYP2A6、CYP2C8、CYP2D6和CYP2E1活性具有影響作用。POR（rs10954732）雜合子GA與野生型GG相比，CYP2E1的CLint降低。POR（rs2286823）對CYP2E1有類似的影響，雜合子GA與野生型GG相比，CYP2E1的CLint降低。此外，POR（rs4732516）雜合子CG與野生型CC相比，CYP2D6的CLint更高，同時，突變純合子GG與CG相比，CLint顯著下

36、降。POR（rs1057870）雜合子GA與野生型GG相比，CYP1A2的CLint升高。
　　在對照組，POR基因突變對CYP2B6、CYP2C8、CYP2E1活性產(chǎn)生影響。POR（rs1057868）雜合子CT比野生型CC的CYP2B6和CYP2C8的CLint更低；POR（rs3823884）雜合子AC比野生型AA的CYP2E1活性下降；POR（rs2286823）雜合子CT、突變純合子TT均比野生型CC的CYP2E1活性降

37、低。
　　HCC組和對照組相比較，POR的基因多態(tài)性均對CYP2C8和CYP2E1活性產(chǎn)生影響；但在HCC組有更多的CYP同工酶（CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6）活性受到POR基因多態(tài)性影響。
　　7.肝組織纖維化程度對CYP酶活性的影響
　　組織病理學結果顯示，HCC病人的肝組織伴有肝纖維化或肝硬化病變。為了分析病變程度對CYP酶活性的影響，分別測定纖維化和肝硬化兩個亞組的酶動力學參數(shù)（Km、Vmax和CL

38、int）。
　　與纖維化組相比，肝硬化組CYP2C8的Km升高、CYP2D6的Km降低。對于CLint，CYP2D6的CLint在兩組之間存在差異，肝硬化組比纖維化組的CYP2D6 CLint升高了53.6%（8.4 vs.3.9μl·min-1·mg-1，P<0.05）。
　　與正常對照組相比，對于Km，纖維化組和肝硬化組中CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C19、CYP2E1和CYP3A4/

39、5的Km均升高；CYP2D6的Km在肝硬化組降低（21.4 vs.28.9μM，P<0.05）但在纖維化組無改變。對于Vmax，纖維化組和肝硬化組中CYP1A2和CYP2C8的值降低；CYP2A6、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4/5的值均升高。對于CLint，纖維化組和肝硬化組中 CYP1A2、CYP2C8和CYP2C19的CLint均降低；CYP2C9和CYP2E1的CLint均升高。不同的是，肝

40、硬化組中CYP2D6的CLint比對照組升高（8.4 vs.3.5μl·min-1·mg-1，P<0.05），但纖維化組中CYP2D6的CLint無改變。
　　8.人口學因素對CYP酶活性的影響
　　以CLint代表CYP酶活性，分析了性別、吸煙、飲酒等因素對CYP酶活性的影響。在 HCC組中，女性的CYP2A6活性比男性增加（164.1 vs.142.1μl·min-1·mg-1，P<0.05）；與吸煙者相比，不吸煙者具有

41、較高的CYP2D6活性（9.0 vs.5.3μl·min-1·mg-1，P<0.05）；不飲酒者相對飲酒者，CYP2D6的活性明顯升高（8.5 vs.5.0μl·min-1·mg-1，P<0.05）。
　　在對照組中，不吸煙者與吸煙者相比，CYP2D6的CLint降低（3.0 vs.5.7μl·min-1·mg-1，P<0.05）。
　　HCC組與對照組相比，吸煙對兩組的影響存在顯著差異。吸煙的HCC病人比不吸煙者具有更低的

42、CYP2D6活性，而在正常對照組中吸煙者具有較高的CYP2D6活性；性別和飲酒能夠引起HCC病人CYP酶活性變化，但對正常對照組無顯著影響。
　　結論
　　1.肝癌病人 CYP酶的活性受到疾病影響而顯著改變，CYP1A2、CYP2C8和CYP2C19活性降低，CYP2C9、CYP2D6和CYP2E1活性增加，CYP2A6、CYP2B6和CYP3A4/5活性無改變，且酶活性存在較大的個體差異。
　　2.肝癌病人CYP2D