膽堿酯酶抑制劑BYZX在人肝微粒體中的代謝途徑研究.pdf

1、BYZX[(E)-2-(4-((diethylamino)methyl)benzylidene)-5，6-dimethoxy-2，3-dihydro-indenone]是在第二代膽堿酯酶抑制劑多奈哌齊的茚酮結(jié)構(gòu)母核上進(jìn)行改造，作為治療阿爾茨海默病而合成的新化合物。臨床前研究發(fā)現(xiàn)，BYZX的吸收較快，但生物利用度很低，根據(jù)前期的體內(nèi)外研究，推測首過效應(yīng)是導(dǎo)致其生物利用度低的主要原因。本課題重點(diǎn)研究BYZX在人肝微粒體中的I相代謝，鑒定BY

2、ZX經(jīng)肝微粒體代謝生成的主要產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，考察代謝途徑中參與的主要代謝酶，并建立LC-MS/MS定量方法進(jìn)行酶促動力學(xué)測定和比較，為體內(nèi)可能的代謝途徑的推測以及代謝物中潛在的新藥開發(fā)對象提供參考信息。
　　 1.BYZX在人肝微粒體中的代謝物鑒定
　　 目的：研究BYZX在人肝微粒體中的代謝情況，鑒定主要代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并制備代謝產(chǎn)物作為對照品。
　　 方法：采用UPLC-MS/MS方法獲得BYZX在人肝微粒

3、體中孵育的代謝物圖譜，確定代謝物的色譜峰，并檢測其精確質(zhì)量數(shù)和子離子信息；收集口服BYZX的大鼠的尿液，對比液相色譜.質(zhì)譜聯(lián)用譜圖，找到與孵育體系中對應(yīng)的主要代謝物，并在制備液相色譜儀上進(jìn)行分離純化，獲得該代謝物純品進(jìn)行核磁共振波譜檢測(1H-NMR，13C-NMR，1H-1H COSY，HMQC和HMBC)，鑒定其結(jié)構(gòu)；對比該代謝物和其他代謝物的質(zhì)譜子離子，結(jié)合由精確質(zhì)量數(shù)推測的分子式，確定代謝物的結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果：在人肝微

4、粒體孵育體系中檢測到3個差別峰，即BYZX的代謝物M1～M3；經(jīng)過分離純化，在尿液中制取5 mg的M1代謝物，純度大于98％(HPLC檢測)，可用于核磁共振波譜檢測和作為分析方法建立的對照品；結(jié)合核磁共振波譜和質(zhì)譜鑒定結(jié)果，確定代謝物分別為：還原并去乙基產(chǎn)物M1[(E)-2-(4-((ethylamino)methyl)benzyl)-5，6-dimethoxy-2，3-dihydroindenone]，還原產(chǎn)物M2[(E)-2-(4-

5、((diethylamino)methyl)benzyl)-5，6-dimethoxy-2，3-dihydroindenone]，去乙基產(chǎn)物M3[(E)-2-(4-((ethylamino)methyl)benzylidene)-5，6-dimethoxy-2，3-dihydroindenone]。
　　 結(jié)論：BYZX經(jīng)人肝微粒體可發(fā)生N-去乙基和C=C雙鍵還原反應(yīng)，生成3個不同代謝物。
　　 2.BYZX在人肝微粒體

6、中代謝動力學(xué)的測定
　　 目的：建立靈敏、快速且可同時測定所有產(chǎn)物的方法，測定BYZX在人肝微粒體中發(fā)生N-去乙基和C=C雙鍵還原反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)。
　　 方法：利用化學(xué)合成的對照品建立LC-MS/MS定量方法，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證；以不同底物濃度下產(chǎn)物生成速率繪制酶動力學(xué)曲線，計(jì)算動力學(xué)參數(shù)。
　　 結(jié)果：建立了LC-MS/MS方法用于測定孵育體系中的還原產(chǎn)物M2與去乙基產(chǎn)物M3。該方法條件下，M2在13.6 nm

7、ol/L～5449.6 nmol/L范圍內(nèi)線性良好(r2=0.9997)，BYZX相對定量M3時，在5 nmol/L～1600 nmol/L范圍內(nèi)線性良好(r2=1.0000)，方法回收率分別在99.9％～112.3%和87.7％～101.5％，日內(nèi)精密度均小于11.0%，日間精密度均小于6.6%。BYZX在線性反應(yīng)時間內(nèi)主要生成一步代謝物M2與M3，且按上述定量方法檢測的M2與M3生成速率之和，與BYZX的消耗速率相當(dāng)。BYZX人肝微

8、粒體中的代謝動力學(xué)符合米氏方程，還原生成M2的Km=(21.4±1.4)μM，Vmax=(0.252±0.008)nmol/min/mg protein；去乙基生成M3的Km=(46.4±5.9)μM，Vmax=(0.111±0.008)nmol/min/mg protein；計(jì)算清除率CLint=Vmax/Km分別為(11.78×10-3)mL/min/mg protein，(2.39×10-3)mL/min/mg protein。<

9、br>　　 結(jié)論：LC-MS/MS分析方法可用于同時檢測BYZX及其代謝物；BYZX在人肝微粒體中，經(jīng)C=C雙鍵還原代謝清除比經(jīng)N-去乙基代謝清除更快。
　　 3.人肝微粒體中BYZX相關(guān)代謝酶的確證和動力學(xué)研究
　　 目的：對人肝微粒體中參與BYZX代謝的主要代謝酶進(jìn)行確證，并進(jìn)行動力學(xué)特征的比較。
　　 方法：應(yīng)用化學(xué)抑制劑、重組表達(dá)的人細(xì)胞色素P450酶，以及不同人肝微粒體中代謝相關(guān)性等研究方法，對BYZ

10、X代謝途徑中相關(guān)代謝酶進(jìn)行確證；對中間代謝物M2與M3代謝生成終產(chǎn)物M1進(jìn)行單獨(dú)研究，用類似方法確證主要代謝酶亞型，并進(jìn)行動力學(xué)比較。
　　 結(jié)果：CYP3A4和CYP2C8參與BYZX和還原產(chǎn)物M2的N-去乙基反應(yīng)：CYP3A4代謝BYZX時，動力學(xué)曲線呈S型，符合別構(gòu)動力學(xué)特征，用Hill方程擬合，S50=(116.9±49.6)μM，Vmax=(26.4±3.2)pmol/min/pmol enzyme，n=1.30±0.

11、11，CLmax=(n-1)×Vmax/[n(n-1)1/n×S50]=98.69×10-6 mL/min/pmol enzyme；CYP2C8代謝BYZX時符合米氏方程，Km=(62.1±8.2)μM，Vmax=(0.59±0.03)pmol/min/pmol enzyme，CLint=9.50×106 mL/min/pmol enzyme；CYP3A4和CYP2C8代謝M2時，均符合米氏方程，Km值分別是(65.2±7.2)μM和(

12、143.2±17.7)μM，Vmax值分別是(3.14±0.13)pmol/min/pmol enzyme和(2.22±0.14)pmol/min/pmol enzyme，CLint分別是48.16×10-6mL/min/pmol enzyme和15.50×10-6mL/min/pmol enzyme。而介導(dǎo)BYZX和去甲基產(chǎn)物M3發(fā)生C=C雙鍵還原的代謝酶需要NADPH作為輔酶，但它既不屬于CYPs，也不屬于FMOs。
　　

13、結(jié)論：BYZX在人肝微粒體中經(jīng)CYP3A4和CYP2C8介導(dǎo)發(fā)生N-去乙基代謝產(chǎn)生M3，且CYP3A4催化占主導(dǎo)地位，但與CYP2C8不同的是，CYP3A4介導(dǎo)BYZX的去乙基代謝過程符合變構(gòu)酶動力學(xué)模型，表現(xiàn)出正協(xié)同效應(yīng)；中間代謝物M2的去乙基反應(yīng)與BYZX類似，但CYP3A4代謝符合典型米氏方程；BYZX與中間代謝物M3的C=C雙鍵還原相關(guān)的酶還有待研究。
　　 4.對介導(dǎo)C=C雙鍵還原的酶的初步探究
　　 目的：初

14、步推測肝細(xì)胞中介導(dǎo)BYZX發(fā)生C=C雙鍵還原的酶系。
　　 方法：利用昆蟲細(xì)胞Sf9單獨(dú)表達(dá)NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶(或稱OR)，考察OR是否參與BYZX的還原；考察5α-還原酶抑制劑非那雄胺是否抑制該還原代謝反應(yīng)；觀察BYZX在人肝細(xì)胞胞漿里的還原代謝，并加入雙香豆素、吲哚美辛、芐叉丙酮等化合物，考察抑制情況并測定IC50。
　　 結(jié)果：空白Sf9細(xì)胞的S9部分對BYZX有很強(qiáng)的還原作用，而表達(dá)OR的Sf9并

15、沒有更強(qiáng)的還原BYZX的能力；BYZX在人肝細(xì)胞胞漿中也能夠被還原，且速度更快，動力學(xué)參數(shù)為Km=(38.9±2.5)μM，Vmax=(3.56±0.07)nmol/min/mg protein，CLint=0.092 ml/min/mg protein；非那雄胺和芐叉丙酮沒有明顯抑制作用，雙香豆素和吲哚美辛有明顯抑制，IC50值分別為1.6μM和18.8μM。
　　 結(jié)論：人肝細(xì)胞微粒體中的OR酶和Sα-還原酶不參與BYZX的