基于多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方法評(píng)估中藥對(duì)肝微粒體CYP450的調(diào)控作用研究.pdf_第1頁(yè)
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1、目的:臨床用藥過(guò)程中,大部分藥物進(jìn)入體內(nèi)主要通過(guò)肝臟的藥物代謝酶進(jìn)行代謝,不同的藥物對(duì)藥物代謝酶細(xì)胞色素P450酶(Cytochromes p450,CYP450)具有不同的影響作用,針對(duì)中藥藥物代謝酶?jìng)鹘y(tǒng)定量研究方法具體主要有以下三個(gè)方面:1)基于免疫印跡法的蛋白豐度定量;2)基于實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)的mRNA豐度檢測(cè);3)基于探針?biāo)幬锓ǖ拿富钚詼y(cè)定。CYP450家族蛋白豐度較低,同源性高,免疫印跡法無(wú)法對(duì)同源性高,缺乏針對(duì)特異抗原決

2、定簇抗體的CYP450亞型進(jìn)行定量,例如CYP3A4和CYP3A5,CYP1A2和CYP1A1等;mRNA水平無(wú)法正確評(píng)估相應(yīng)蛋白水平,兩種實(shí)驗(yàn)方法分別存在特異性不強(qiáng)和準(zhǔn)確度不高,重現(xiàn)性不好等缺點(diǎn),基于探針?biāo)幬锓ǖ拿富钚詼y(cè)定方法只針對(duì)幾種主要的CYP450進(jìn)行研究,罕見(jiàn)的CYP450亞型極少有相關(guān)報(bào)道,因此需要建立新的特異性更強(qiáng)的高通量CYP450豐度測(cè)定方法,探究CYP450亞型參與的中藥代謝過(guò)程以及中藥對(duì)CYP450豐度的調(diào)控作用,

3、以及中藥藥物配伍使用時(shí)由于CYP450的變化引起藥物相互作用。獲取藥物對(duì)CYP450亞型的調(diào)控信息可避免因CYP450的變化所引起的藥物失效以及副反應(yīng)。選取幾種常見(jiàn)的傳統(tǒng)中藥進(jìn)行CYP450研究具有較好臨床意義。
  方法:本研究基于多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Multiple reaction monitoring,MRM)結(jié)合定量串聯(lián)體(Quantification concatamers,QconCAT)技術(shù)對(duì)肝微粒體酶CYP450亞型進(jìn)行

4、定量,MRM是一種可對(duì)靶向肽段離子進(jìn)行篩選、監(jiān)測(cè),進(jìn)而對(duì)肽段進(jìn)行定量的質(zhì)譜方法,通過(guò)定量串聯(lián)體法獲取得到純度極高的重型同位素肽段作為內(nèi)標(biāo),與正常的樣品相應(yīng)肽段在同一個(gè)色譜保留時(shí)間出峰,根據(jù)兩者的差異,對(duì)目的蛋白樣品豐度進(jìn)行定量。本實(shí)驗(yàn)將MRM結(jié)合QconCAT技術(shù)應(yīng)用于對(duì)中藥(丹參、白芍、附子、參附、人參)處理后大鼠肝臟微粒體CYP450豐度進(jìn)行定量,研究五味藥物分別對(duì)CYP450亞型的調(diào)控作用,同時(shí)將該方法進(jìn)一步運(yùn)用到對(duì)細(xì)胞內(nèi)的CYP

5、3A4定量研究中,證實(shí)利福平對(duì)CYP3A4豐度的誘導(dǎo)作用。
  結(jié)果:1)方法學(xué)評(píng)估:選用多濃度質(zhì)控樣本進(jìn)行方法學(xué)研究,定量方法精密度在3.85%以?xún)?nèi),相對(duì)誤差在4%以?xún)?nèi),線性系數(shù)大于0.9。成功對(duì)11種大鼠肝微粒體CYP450亞型蛋白的21條肽段進(jìn)行絕對(duì)定量;2)正常大鼠肝臟微粒體中CYP450酶亞型CYP1A1,CYP1A2,CYP2B1, CYP2B2,CYP2C6,CYP2C11, CYP2D1,CYP3A1,CYP3A2

6、,CYP17A1和CYP2E1蛋白平均豐度分別為15.12,14.43,5.63,2.37,6.05,18.27,16.24,4.78,48.2,69.32,66.66fmol/μg微粒體。五味中藥(丹參、白芍、附子、參附、人參)作用后大鼠肝藥酶CYP450豐度進(jìn)行定量,并與對(duì)照組相比,丹參對(duì)CYP1A1,CYP2B2具有抑制作用,對(duì)CYP1A2, CYP2B1具有誘導(dǎo)作用。人參抑制CYP3A2,CYP2C11和CYP17A1的表達(dá),白

7、芍對(duì)CYP1A1,CYP2C6,CYP2C11,CYP3A2產(chǎn)生抑制作用,對(duì)CYP1A2,CYP2D1產(chǎn)生誘導(dǎo)作用,附子對(duì)CYP1A1,CYP2D1起誘導(dǎo)作用,而對(duì)其他大部分CYP亞型CYP2C6,CYP2C11,CYP3A2,CYP17A1都有抑制作用。參附抑制CYP1A1, CYP2C6,CYP2C11,CYP2E1,CYP3A2蛋白的表達(dá),僅誘導(dǎo)CYP1A2和CYP3A1等規(guī)律;3)將該方法進(jìn)一步用于對(duì)原代肝細(xì)胞主要肝藥酶CYP3

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