Ad-pre-microRNA-193b重組腺病毒的構(gòu)建及其抗白血病效應(yīng)探討.pdf

1、目的:構(gòu)建microRNA-193b（miR-193b）前體Ad-pre-miR-193b重組腺病毒載體，并鑒定其在慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562中的表達(dá)水平，進(jìn)一步探討高效表達(dá)miR-193b對(duì)K562細(xì)胞的抑制效應(yīng)及其作用機(jī)制，為后續(xù)研究miR-193b在CML動(dòng)物模型中的抗白血病效應(yīng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.化學(xué)合成miR-193b cDNA序列，克隆進(jìn)入pAdTrack-CMV穿梭質(zhì)粒，經(jīng)Pme I酶切線性

2、化后轉(zhuǎn)入含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)中進(jìn)行同源重組，獲得pAd-miR-193b重組腺病毒質(zhì)粒，再經(jīng)PacI線性化后轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞中包裝、擴(kuò)增。收集病毒后感染K562細(xì)胞（設(shè)為Ad-pre-miR-193b組），同時(shí)設(shè)空白組（K562細(xì)胞組）及空載病毒組（Ad組），采用QRT-PCR檢測(cè)K562細(xì)胞中miR-193b基因的表達(dá)水平。
　　2.經(jīng)鑒定的Ad-pre-miR-193b重組腺病毒感

3、染K562細(xì)胞，同時(shí)設(shè)空白組（K562細(xì)胞組）及空載病毒組（Ad組），采用QRT-PCR檢測(cè)miR-193b基因的表達(dá)水平；QRT-PCR和Western Blot分別檢測(cè)bcr/abl融合基因、BCR/ABL融合蛋白的表達(dá)水平；CCK-8法檢測(cè)K562細(xì)胞的增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)K562細(xì)胞凋亡率。
　　3.經(jīng)鑒定的Ad-pre-miR-193b重組腺病毒感染K562細(xì)胞后，采用Western Blot檢測(cè)凋亡蛋白c

4、aspase-3的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.pAdTrack-CMV-pre-miR-193b重組穿梭質(zhì)粒和pAd-pre-miR-193b重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶鑒定及測(cè)序分析顯示構(gòu)建成功；重組腺病毒質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中包裝成功，并能夠高效轉(zhuǎn)染 K562細(xì)胞；與對(duì)照組相比，QRT-PCR檢測(cè)顯示重組腺病毒載體感染K562細(xì)胞后其miR-193b基因表達(dá)水平明顯增加（P<0.01）。
　　2.與對(duì)照相比，

5、K562細(xì)胞在感染Ad-pre-miR-193b重組腺病毒后，其miR-193b表達(dá)水平顯著升高；bcr/abl融合基因及BCR/ABL蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)（P<0.05）；K562細(xì)胞增殖能力降低（P<0.05）；K562細(xì)胞凋亡水平明顯上升（P<0.05），caspase-3表達(dá)水平增高（P<0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建Ad-pre-miR-193b重組腺病毒，并能高效感染K562細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)miR-193b