重組hIFITM3腺病毒的構建及抗流感病毒作用研究.pdf

1、近年發(fā)現(xiàn)的一類宿主限制因子，干擾素誘導跨膜蛋白(IFITMs)。該類因子可抑制包膜和無包膜病毒的增殖，并且在多種細胞中有一定的組成型表達，其中經研究證實IFITM3可以抵抗多種病毒的感染，其中包括西尼羅河病毒，流感病毒，登革熱等。IFITM3可通過多種途徑來發(fā)揮抗病毒感染作用。據(jù)報道，IFITM3對以H1N1、H5N1、H7N9及H3N2、為外膜的假型病毒的進入具有抑制作用。其能夠有效作用于宿主細胞表面受體與流感病毒表面糖蛋白血凝素結合

2、之后，包膜與內吞形成的胞內體膜融合之前的感染胞內體過程。
　　為深入研究IFITM3的抗病毒作用，本研究首先利用腺病毒pacAd載體構建了含有人干擾素誘導跨膜蛋白IFITM3目的基因的穿梭質粒，再與骨架質粒pAd5共轉染HEK-293細胞，包裝出含IFITM3基因的重組腺病毒，隨后用PCR及Western blot檢測該重組野生型腺病毒、腺病毒與正常細胞中IFITM3蛋白表達量的差異。本研究同時用Western blot方法檢測同

3、源細胞A549和異源細胞MDCK中IFITM3蛋白的表達，以選擇合適的細胞模型。用MTS方法分別檢測重組腺病毒對MDCK和A549細胞活性的影響。流感病毒感染細胞，用MTS方法，選擇病毒滴度為100 MOI、感染時間為24h進行實驗，檢測細胞活性變化。MDCK和A549細胞接種重組腺病毒以及流感病毒后12h、24h、36h和48h分別收取RNA和細胞蛋白，用實時熒光定量PCR方法檢測流感病毒M2基因表達量，用Westernblot方法檢

4、測流感病毒HA蛋白表達量。
　　PCR及Western blot檢測顯示本研究新構建的重組腺病毒IFITM3蛋白表達量顯著高于野生型腺病毒和正常細胞，表明成功構建含有IFITM3的重組腺病毒。MTS實驗發(fā)現(xiàn)腺病毒對細胞活性有一定抑制作用且具有時間和劑量依賴性，但rAd-IFITM3與wtAd5組之間無顯著性差異，而流感病毒在感染細胞24h后，對細胞產生明顯的抑制作用，且呈明顯的時間與劑量依賴效應。Western blot結果顯示，

5、在接種流感病毒后12h時，HA蛋白的表達量最低且顯著低于其他時間點。熒光定量PCR結果表明，過表達ITIFM3的A549細胞在不同時間點均對流感病毒轉錄水平有明顯的抑制作用;對于MDCK細胞，6h、12h具有明顯抑制作用。
　　綜上所述，本實驗成功構建了含有IFITM3基因的重組腺病毒rAd-IFITM3，該重組腺病毒rAd-IFITM3在接種MDCK和A549細胞后，可在蛋白表達水平和基因轉錄水平上對流感病毒起到抑制的作用。本研